[보고서]내인성 신경세포재생 촉진 프로토콜 개발 및 이를 통한 노화, 뇌허혈 개선 연구

황인구

내인성 신경세포재생 촉진 프로토콜 개발 및 이를 통한 노화, 뇌허혈 개선 연구
Development of protocol and validation of effects to promote endogenous neurogenesis in animal models of aging and ischemic models 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	서울대학교 Seoul National University
연구책임자	황인구
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2019-06
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO201900021684
과제고유번호	1711090148
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2020-05-23
키워드	신경세포재생.해마.노화.뇌허혈.단백질체분석.면역조직화학염색.

초록 ▼

□ 연구개요
신경세포재생을 효율적으로 촉진시킬 수 있는 프로토콜을 확립하고, 일시적인 앞뇌허혈 모델(transient forebrain ischemic model)을 통해 신경세포사멸 이후에 신경세포재생의 지속적인 촉진이 뇌허혈에 의한 재활에 어떠한 영향을 미치는지 확인하며,18개월령 이상의 노화가 진행 중인 동물을 대상으로 신경세포재생 촉진이 노화의 억제에 어떠한 영향을 미치는지 추적하여 신경세포재생과 재활간의 상관관계를 확인하고자 하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
본 연구는 1차년도에서는 일반 성체 마우스를 대상으로 하여, 신경세포재생이 있다고 알려져 있는 pyridoxine투여, 전기침, treadmill exercise, environmental enrichment, 천연 추출물 투여 등의 단독 투여와 이들의 조합을 하여, 신경세포재생을 지속적으로 촉진시키는 물질 또는 방법을 확인하고 이를 바탕으로 2차년도에서는 뇌허혈, 3차년도에서는 노화 모델에 효능을 확인하고자 하였음. 본 연구를 통해 단기간 투여로 신경세포재생 촉진이 알려진 물질도 8주의 기간으로 진행되면 신경세포재생 촉진이 매우 미미하게 이루어지는 것을 확인하여, 신경세포재생은 매우adaptation이 빠른 것을 확인할 수 있었음. 그러나 이들을 무작위적으로 조합하여 동물에게 처치하면 신경세포재생을 장기간 유도할 수 있음을 확인하였으며, 이러한 무작위적 처치가 신경가소성에 관련된 다양한 물질을 작용하는 것을 확인하였음. 이러한 내용을 바탕으로 2차년도에서 뇌허혈에 의한 세포손상이 유발된 동물에 8주간 적용하여 신경세포재생 및 세포손상 부위에서 세포의 생성을 확인하였으며, 대조군에 비해 신경세포재생이 촉진되고, 세포손상 부위에서 새로운 세포들이 나타나는 것을 확인하였음. 3차년도에서는 노화과정에 있는 18-20개월령 동물에 적용하여 노화에따른 기억력 감퇴를 억제하고, 감소된 신경세포재생 능력을 유의적으로 향상시키는 것을 확인하여, 기존의 연구 목표에 대하여, 충실한 연구결과가 달성하였다고 생각됨.

□ 연구개발결과의 중요성
기전의 대부분의 연구에서 3-4주 투여, 처치를 통한 신경세포재생 촉진은 신경손상 및 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 수단으로 생각되어 왔으나, 본 연구를 통하여 지속적인 신경세포재생 촉진을 이룩하기는 어렵다는 것을 확인하였음. 또한 다양한 신경세포재생 촉진 방법을 통해 무작위적으로 처치함에 따라 뇌손상 시 신경세포 생성을 촉진하며, 노화 등에 의한 신경손상을 억제할 수 있으며, 이를 바탕으로 향후 뇌손상 개선 연구 시에는 단일 방법에 의한 손상 개선보다는 복합적인 물질/방법을 통한 손상 개선 및 무작위적인 방법에 의해 뇌의 adaptation을 억제할 수 있는 방법으로 치료에 대한 패러다임을 바꾸는 것이 중요하다고 생각됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구배경 ... 4
2) 연구의 필요성 및 중요성 ... 7
3) 연구의 목표 및 내용 ... 7
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 8
1) 각 신경세포재생 프로토콜 적용군에서 신경세포재생의 촉진 확인 ... 8
2) 프로토콜G를 통한 인지능력 확인 ... 9
3) 프로토콜G를 통한 monoamine의 영향 확인 ... 9
4) 프로테옴 분석을 통한 신경세포재생 기전 분석 ... 11
5) [18F]FDG-PET/CT를 이용한 brain connectivity 확인 ... 13
6) 뇌허혈 모델의 작성 및 spontaneous motor activity를 통한 신경세포사 유도 동물 확립 ... 13
7) 뇌허혈에 의한 신경세포사 유도 동물의 인지기능 확인 ... 13
8) 뇌허혈에 의한 신경세포사 유도 동물에서 신경세포사멸 및 신경아교세포 확인 ... 14
9) 뇌허혈에 의한 신경세포사 유도 동물에서 신경세포재생 및 기전 확인 ... 15
10) 노화 동물에서 인지기능의 영향 확인 ... 16
10) 노화 동물에서 신경세포재생 확인 ... 17
3. 연구개발결과의 중요성 ... 18
4. 참고문헌 ... 19
5. 연구성과 ... 21
대표적 연구실적 ... 22
끝페이지 ... 38

표/그림 (29)

표 애완견과 사람의 나이 비교
표 Breed별 평균 수명연령
표 KOSIS 국가통계포털, 2016년 현재
표 연령별 인구 변화 추이 (통계청, 2015)
표 질환별 의료비용의 비교 추이-예상치 (출처: 생명공학정책연구센터(2007), 바이오신약·장기제품군별/주요 질환별 세계 및 국내시장현황과 전망분석에 관한 연구)
표 전세계 항노화 시장의 규모 및 향후 전망 (출처: BCC Research 2009 & Global Industry Analyst)
표 뇌의 neurogenic region, 왼쪽 subventricular zone(SVZ), 오른쪽 subgranular zone(SGZ)
표 과립밑구역에서 세포의 분화 도식화
표 정상뇌와 뇌허혈 뇌에서 신경세포재생의 차이
표 신경세포재생 촉진을 위한 그룹별 프로토콜
표 Immunohistochemistry for Ki67 in the dentate gyrus in vehicle-treated control (A), pyridoxine (B), exercise (C), EGCG (D), environmental enrichment (E), and various paradigm of alternative treatments of these factors (F-H). Ki67 immunoreactive (+) nuclei are mainly detected in the subgranular zone of dentate gyrus. Note that Ki67+ nuclei are few in the vehicle-treated control group, while these nuclei are abundant in the groups treated with various paradigm of these factors. In addition, the enhanced ability of Ki67+ nuclei is prominent in the unpredictable treatments of these factors. GCL, granule cell layer; ML, molecular layer; PL, polymorphic layer. Scale bar = 50 um. (I) Number of Ki67+ nuclei per section for each group (n=7 per group; *p < 0.05, versus vehicle-treated control group). Data are presented as mean ± SEM
표 Immunohistochemistry for DCX in the dentate gyrus in vehicle-treated control (A), pyridoxine (B), exercise (C), EGCG (D), environmental enrichment (E), and various paradigm (F-H) of alternative treatments of these factors. DCX immunoreactive (+) neuroblasts are found in the dentate gyrus; cytoplasm in the subgranular zone of dentate gyrus and their dendrites are extended into two-thirds of molecular layer (ML) of dentate gyrus. Note that DCX+ neuroblasts are relatively abundant in the dentate gyrus of unpredictable treated groups (G6 and G7) of these factors. GCL, granule cell layer; PL, polymorphic layer. Scale bar = 50 um . (I) Number of DCX+ neuroblasts per section for each group (n=7 per group; *p < 0.05, versus vehicle-treated control group). Data are presented as mean ± SEM
표 Effect of Protocol G on levels of serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT), its metabolite (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA), and ratio (5-HIAA/5-HT) in the control and Protocol G-treated groups (n = 5 mice per group; *P< 0.05, versus control group)
표 Immunohistochemistry for TH in the dentate gyrus in vehicle-treated control (A) and Protocol G treated (B) group. TH immunoreactive fibers are found in the polymorphic layer (PL) and molecular layer (ML) of dentate gyrus. Note that TH immunoreactive fibers are abundant in the protocol G-treated group compared to that in the control group. GCL, granule cell layer. Scale bar = 50 um. C: Relative optical densities (ROD) are expressed as a percentage of the value of the TH immunoreactivity in the dentate gyrus of control group (n=5 in each group). Data shown as mean ± SEM
표 Gel spots obtained
표 2D-DIGE proteomes. Two dimensional-fluorescence difference gel electrophoresis (DIGE) gel of hippocampal proteins labelled with CyDye™ fluors was performed to compare the proteomes from control and Protocol G-treated groups
표 Identification of differentially expressed proteins. Three-dimensional representations of spot volumes were derived from differentially expressed proteins
표 Western blot analysis. Protein levels are expressed as a percentage of the level of differentially expressed proteins from proteomic analysis, normalized to the β-actin protein level, in the hippocampal homogenates of control and Protocol G treated group. Relative optical densities (ROD) are expressed as a percentage of the value of control group (n=5 in each group, *p< 0.05, significantly different from the control group). Data shown as mean ± SEM
표 Brain connectivity analysis based on [18F]FDG-PET/CT. Brain connectivity is enhanced in the Protocol G treated group compared to that in the control group in several brain regions and its connective structures including olfactory bulb, hippocampus, thalamus, hypothalaus, and ventricle-associated structures
표 The ratio of locomotor activity in gerbils before and 1 day after ischemia/reperfusion. Spontaneous locomotor activity is evaluated in terms of entire distance (meters) traveled before and 1 day after ischemia/reperfusion
표 Exploration patterns were video recoded in sham-operated (Sham) and ischemia-operated animals with (Ischemia+P) or without (Ischemia) neurogenic protocol G; black lines are exploring patterns of gerbils, yellow circle and green square represent two different objects. Recognition index measured during novel object recognition of gerbils following forebrain ischemia and neurogenic protocol treatment (n = 10 per group; *P < 0.05, significantly different from the Sham group, #P < 0.05, significantly different from the Ischemia group). The bars indicate standard error of the mean (SEM)
표 Cresyl violet staining in the hippocampus of sham-operated (Sham, A), ischemia-operated group without neurogenic protocol G (Ischemia, B), and ischemia-operated group with neurogenic protocol G (Ischemia-P, C). Scale bar = 50 μm. D: The relative number of cresyl violet positive neurons per section in all the groups (n = 5 per group; *P < 0.05, significantly different from the Sham group, #P < 0.05, significantly different from the Ischemia group). The bars indicate standard error of the mean (SEM)
표 Immunohistochemical staining for glial fibrillary acidic protein and ionized calcium-binding adapter molecule 1 in the hippocampus of ischemia-operated group without neurogenic protocol (Ischemia, A and C), and ischemia-operated group with neurogenic protocol (B and D). Scale bar = 50 μm
표 Immunohistochemiscal staining for DCX in the hippocampus of sham-operated (Sham, A), ischemia-operated group without neurogenic protocol G (Ischemia, B), and ischemia-operated group with neurogenic protocol G (Ischemia-P, C). Scale bar = 50 μm. D: The relative density of DCX immunoreactivity per section in all the groups (n = 5 per group; *P < 0.05, significantly different from the Sham group, #P < 0.05, significantly different from the Ischemia group). The bars indicate standard error of the mean (SEM)
표 Immunohistochemiscal staining for phosphorylated cAMP response elements binding protein (pCREB) in the hippocampus of sham-operated (Sham, A), ischemia-operated group without neurogenic protocol (Ischemia, B), and ischemia-operated group with neurogenic protocol (Ischemia-P, C). Scale bar = 50 μm. D: The relative density of pCREB immunoreactivity per section in all the groups (n = 5 per group; *P < 0.05, significantly different from the Sham group, #P < 0.05, significantly different from the Ischemia group). The bars indicate standard error of the mean (SEM)
표 Western blot analysis of Arc, BDNF, NR1, NR2A/B, PSD95, and synapsin in the hippocampal homogenates of the sham-operated (Sham), ischemia-operated group without neurogenic protocol (Ischemia), and ischemia-operated group with neurogenic protocol (Ischemia-P)
표 Morris water maze and novel object recognition testing of C57BL/6 mice at 22-24 months. Each point represents the mean time to find the hidden platform, three trials per day, +SEM (aP < 0.05, control group and bP<0.05, Aged C57BL/6 vs. Aged C57BL/6 with protocol G treatment). Note that the aged mice show almost no savings from the level of performance attained at 22-24 months and do not exhibit a learning curve over the 4 days (12 trials) of testing. In contrast, the protocol G treatment significantly decreases the latency of time
표 Immunohistochemistry for Ki67 in the dentate gyrus in adult (A), aged mice without (B) or with protocol G treatment (C). Note that Ki67+ nuclei are few in the aged group without protocol G treatment, while these nuclei are abundant in the groups treated with protocol G. GCL, granule cell layer; ML, molecular layer; PoL, polymorphic layer. Scale bar = 50 um. (D) Number of Ki67+ nuclei per section for each group (n=8 per group; ap < 0.05, versus adult group; bp < 0.05, versus aged group). Data are presented as mean ± SEM
표 Immunohistochemistry for DCX in the dentate gyrus in adult (A), aged mice without (B) or with protocol G treatment (C). Note that DCX+ neuroblast are few in the aged group without protocol G treatment, while these neuroblasts are abundant in the groups treated with protocol G. GCL, granule cell layer; ML, molecular layer; PoL, polymorphic layer. Scale bar = 50 um. (D) Relative optical density (ROD) of DCX immunoreactivity in the dentate gyrus per section for each group (n=8 per group; ap < 0.05, versus adult group; bp < 0.05, versus aged group). Data are presented as mean ± SEM

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