[보고서]인간 배아줄기세포유래 망막세포를 이용한 망막변성질환 세포치료제 개발

박지선

보고서 정보

주관연구기관

제일약품주식회사

연구책임자

박지선

참여연구자

유형곤

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2018-07

과제시작연도

2017

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO201900024109

과제고유번호

1711058321

사업명

바이오.의료기술개발

DB 구축일자

2020-08-15

키워드

인간 배아줄기세포.망막시각세포.망막 색소상피세포.망막색소변성.황반변성.human embryonic stem cell.retinal photoreceptor cell.retinal pigment epithelial cell.retinitis pigmentosa.macular degeneration.

표 Undifferentiated hES43
표 Mycoplasma test
표 SNM & RPE generation from SNUhES43
표 Co-culture method for generation of functional photoreceptor
표 광전달경로 대사물질 농도의 light 및 dark condition에서의 차이 측정을 통한 광수용체세포의 in vitro 기능평가 방법 개발
표 Optokinetic response 의 개념도, 망막전위도의 형태와 발생기전 개념도
표 SD rat에서 HMsERG를 측정 중인 모습, optokinetic response를 측정 중인 모습
표 정상 망막 및 망막변성 모델에서 측정한 망막전위도 및 optokinetic response - 두 검사 결과 간에 유의한 상관관계가 관찰됨 (Simple correlation analysis, Pearson's correlation coefficient r = 0.930, p = 0.000
표 좌. 정상 망막 모델의 망막전위도, 중. 망막 변성 유도약물 주사 4일 후 망막 전위도, 우. 망막 변성 유도약물 주사 11일 후 망막 전위도. 망막 변성 유도약물 주사 후 시간이 경과함에 따라 망막 전위도의 진폭 (amplitude)의 감소가 관찰됨
표 망막 변성 유도약물 주사 전, 주사 4일, 11일 후 optokinetic response. 망막 변성 유도약물 주사 후 시간이 경과함에 따라 optokinetic response의 감소가 관찰됨
표 정상 망막, 망막 변성 유도 약물 주사 7일 후
표 배아줄기세포 유래 시각세포전구체 망막하 주사군의 세포치료제를 투여하지 않은 눈, 세포치료제를 투여한 눈
표 배아줄기세포 유래 망막색소상피세포 + 배아줄기세포 유래 시각세포전구체 망막하 주사군의 세포치료제를 투여하지 않은 눈, 세포치료제를 투여한 눈
표 배아줄기세포 유래 시각세포전구체유리체강 주사군의 세포치료제를 투여하지 않은 눈, 세포치료제를 투여한 눈
표 세포치료제를 투여한 군 모두에서 망막 변성에 따른 optokinetic response의 감소가 망막 변성 유도 약물만 주입한 대조군에 비하여 둔화되는 것이 관찰됨
표 마취제 투여로 인한 세포사멸 검사_TUNEL assay
표 실험 모식도
표 면역형광염색법을 이용한 분화율
표 RPE를 이용하여 22가지의 천연물(1㎕/㎖)을 처리하여 본 결과
표 천연물의 농도를 1/10 희석하여 처리 해본 결과
표 hES43. early SNM(P0) 상태에서 all-trans retinoic acid(ATRA) 처리
표 early SNM 단계보다 분화 앞 단계인 embryonic body(EB)형성에서 부터 ATRA 처리
표 이 후 분화과정 단계인 EB를 붙이고(1/2 N2_좌) 5~7일 뒤 N2bF로 배지교환 후(우) 세포 배양 시 관찰 결과
표 EB와 SNM의 형태와 같은 구형태가 아닌 SNM을 mesh처리 하여 dish에 붙인 뒤 single cell 배양을 하며 ATRA를 1uM, 2uM, 5uM, 10uM의 농도로 처리
표 이전 연구사업에서의 농도인 1uM보다 저농도 ATRA(0.1uM, 0.2uM, 0.5uM, 1uM)를 early SNM에 처리
표 microarray 분석
표 다양한 공배양법(5가지)을 이용하여 RPE 분화효율을 비교한 결과
표 시각세포(photoreceptor)를 이용하여 22가지의 천연물(1㎕/㎖)을 처리하여 본 결과
표 천연물의 농도를 1/10 희석하여 처리 해본 결과
표 다양한 공배양법(5가지)을 이용하여 photoreceptor 분화효율을 비교한 결과
표 Xeno-free 미분화 인간배아줄기세포의 주기적인 마이코플라즈마 오염 관찰_좌, Xeno-free 미분화 인간배아줄기세포로부터 분화단계를 거쳐 생성된 신경전구체구의 마이코플라즈마 오염 관찰_우
표 배양 중인 hES43(위)& hES32(아래) cell line 의 각각 두 가지 샘플의 핵형분석 결과
표 Oct4+: 97.124%, Nanog+: 94.3%, Oct4+Nanog+: 94.83% 로 해동 후에도 pluripotent marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰 하였으며_좌, 면역형광염색으로도 확인 함_우
표 SSEA4+: 98.019%, TRA1-60+: 85.906%, SSEA4+TRA1-60+: 87.543%로 동결 후에도 pluripotent marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰 하였으며_좌, 면역형광염색으로도 확인 함_우
표 Oct4+: 89.668%, Nanog+: 93.031%, Oct4+Nanog+: 76.681% 로 해동 후에도 pluripotent marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰 하였으며_좌, 면역형광염색으로도 확인 함_우
표 SSEA4+: 93.340%, TRA1-60+: 51.205%, SSEA4+TRA1-60+: 55.749%로 hES32 cell line보다는 낮지만, 해동 후에도 pluripotent marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰 하였으며_좌, 면역형광염색으로도 확인 함_우
표 해동 한 hES32 cell로 제조한 SNM의 neural precursor cell marker 발현 확인: Nestin+: 97.469%, PAX6+: 97.988%, Nestin+PAX6+: 98.832%. Nestin+: 97.969%, Musashi+: 99.722%, Nestin+Musashi+: 99.071%으로 neural precursor cell marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰하였음
표 해동 한 hES32 cell로 제조한 SNM으로부터 제조한 재형성 SNM(refom SNM)의 neural precursor cell marker 발현 확인: Nestin+: 96.517%, PAX6+: 99.589%, Nestin+PAX6+: 94.144%. Nestin+: 95.784%, Musashi+: 99.556%, Nestin+Musashi+: 92.789%으로 neural precursor cell marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰하였음
표 해동 한 SNM의 neural precursor cell marker 발현 확인: Nestin+: 97.359%, PAX6+: 98.567%, Nestin+PAX6+: 93.042% Nestin+: 98.144%, Musashi+: 99.783%, Nestin+Musashi+: 93.482%으로 neural precursor cell marker의 발현이 잘 유지되고 있는 것으로 관찰하였음
표 텅스텐, 구리, 니켈, 스테인리스, 알루미늄, 철, 티타늄 등 총 7가지의 wire를 이용하여 제작_좌. 멸균을 위해 화염소독을 진행 한 결과 구리, 알루미늄, 철, 티타늄은 wire의 변형이 발생하여 연구에 적합하지 않음을 확인_우
표 사용 중인 텅스텐(1)의 경우 SNM의 절편이 용이하며 적당한 탄성도를 보여 연구에 적합한 반면, 스테인리스(2)는 SNM의 절편은 가능하나 탄성도가 낮고, 니켈(3)의 경우 SNM의 절편이 용이하지 않고, wire의 휘어지는 현상이 나타나 부적합함을 확인 함
표 소독시 wire의 변형이 일어나 연구에 부적합함을 보인 wire의 SNM의 절편 및 탄성도를 테스트 해본 결과 구리(4), 알루미늄(5), 철(6)의 경우 wire의 힘이 약하고 휘어짐 현상이 나타났으며, 티타늄(7)의 경우 텅스텐 보다 wire의 힘이 약함을 관찰 함
표 좌. 광수용체 세포를 명소에서 24시간 배양하였을 때 광소에서 동일기간 배양했을 때보다 cyclic GMP level이 감소하였음, 우. 광전달경로 대사물질 억제제를 추가하였을 때 광소와 암소 배양에서의 cyclic GMP level 차이가 감소하였음
표 상. 기존의 시운동성 반응(optokinetic response) 측정 장치. 주시 방향에 따라 시각(visual angle)의 오차가 발생한다, 하. 개선된 시운동성 반응측정 장치. 주시 방향에 따른 시각의 오차가 발생하지 않음
표 좌. 기존의 시운동성 반응 측정 장치의 시각자극 단계, 중, 우. 개선된 시운동성 반응측정 장치의 시각자극 단계. 다양한 단계의 시각자극을 구현함
표 개선된 시운동성 반응 측정 장치의 시행 장면. 관적인 평가를 위하여 시운동성 반응을 녹화 후 판독 함
표 상. 비-백색증(non-albino) 종자의 홍채 및 동공 모습. 홍채와 동공의 구분이 수월. 하. RCS 랫트의 홍채 및 동공 모습. 홍채와 동공의 구분이 불가능함
표 좌. 실험에 사용된 Royal College of Surgeons (RCS) 랫트
표 RCS 랫트에서 망막변성의 진행단계 동안 시간에 따른 조직학적 변화_PN 35 일부터 178 일까지; hematoxylin과 eosin 염색 후 400배 확대촬영
표 RCS 랫트에서 망막변성의 진행단계 동안 시간에 따른 망막전위도(electroretinogram, ERG) 변화
표 RCS 랫트에서 망막변성의 진행단계 동안 시간에 따른 시운동성 반응의 변화
표 각 실험군에서 세포치료제 투여 후 15일, 30일, 60일, 90일 및 150일 망막전위도 측정을 시행함_Dark-adapted 10 ERG 의 b파 진폭
표 각 실험군에서 세포치료제 투여 후 30일, 60일, 90일 및 150일 시운동성 반응검사를 시행
표 각 실험군에서 세포치료제 투여 후 30일, 60일, 90일 및 150일 조직검사를 시행하여 외핵층의 세포층수를 측정
표 RCS 랫트에서 세포치료제 투여 60일 후 retinal whole mount를 NADPH-diaphorase로 염색하여 혈관복합체(vascular complex) 확인
표 RCS 랫트에서 -세포치료제 투여 후 60일에 FITC를 정맥주사한 후 retinal whole mount를 얻어 혈관누출 여부를 관찰
표 배아줄기세포 유래 망막색소상피세포 및 배아줄기세포 유래 시각세포전구체 망막하 주사 22일 후 촬영한 빛간섭단층촬영 영상(optical coherence tomography, OCT
표 좌. 정상 Brown-Norway 랫트의 9.4T T2* 강조 기울기에코 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI), 우. SPIO 세포표지 된 신경전구체세포(neural precursor cell) 망막하 주입 후 동일한 프로토콜로 촬영한 자기공명영상
표 RPE+photoreceptor 이식 후 1주 뒤 생착능을 확인
표 RPE+photoreceptor 이식 후 1주 뒤 생착능을 확인
표 RPE+photoreceptor 이식 후 1주 뒤 생착능을 확인
표 RPE+photoreceptor 이식 후 1주 뒤 생착능을 확인
표 photoreceptor 이식 후 8주 뒤 생착능을 확인
표 photoreceptor 이식 후 8주 뒤 생착능을 확인
표 photoreceptor 이식 후 8주 뒤 생착능을 확인
표 세포이식 후 세포의 분포 및 이식, 위치 확인을 위해 MRI detection이 가능한 superparamagnetic iron-oxide (SPIO) labeling법 in vitro 테스트
표 도파민 신경세포로의 분화 후 SPIO labeling 6h, 12h, 18h, 24h
표 SPIO labeled 도파민 세포를 파킨슨증후군 원숭이에 주입 후 MRI 촬영
표 인간배아줄기세포 유래 망막색소상피세포 분화법을 통해 제조한 망막색소상피세포의 확인
표 기존 연구에서와 같은 방법으로 SPIO labeling 후 세포원심분리 결과. SPIO염색 후 육안으로 SPIO labeling이 된 것을 확인 가능 함 (yellow 화살표)
표 SPIO labeling 후에도 cell viability_좌, cell proliferation_우 결과
표 SPIO labeling 후에도 망막색소상 세포의 성질이 변하지않음을 면역 형광염색법으로 확인 Control (위), SPIO labeled (아래)
표 SPIO labeling 세포의 이식 후 조직에서 prussian blue 염색을 통해 이식 한 세포의 분포를 확인
표 망망색소상피세포 및 시각세포 표준작업절차서(SOP) 확보
표 OMICS 분석_KEGG view
표 RPE 제조 단계의 다양한 시기 별 small molecule 처리 및 기간 (C:CKI-7, S:SB431542, B:BMP4)
표 EB 형성부터 CSB를 처리
표 EB 형성부터 CSB를 처리. 그림 3의 확대_좌, 바닥에 attach cell_우 (C1/S1/B10: CKI-7: 1uM, SB: 1uM, BMP4: 10ng/ml) (C5/S5/B10: CKI-7: 5uM, SB: 5uM, BMP4: 10ng/ml) (C10/S10/B10: CKI-7: 10uM, SB: 10uM, BMP4: 10ng/ml)
표 RPE cell surface marker인 ZO1의 발현 에는 차이가 없는 반면 early RPE marker인 MiTF의 발현은 CSB를 처리 한 그룹에서 발현이 증가하는 것을 관찰 함으로써, RPE cell로의 분화에 positive effect를 나타낼 것으로 사료됨
표 qRT-PCR. pluripotent markerm 3 germ layer marker 발현 확인
표 qRT-PCR. RPE관련 marker 발현 확인
표 CSB의 처리 시기를 early시기가 아닌 ectoderm lineage로의 분화유도 뒤 그 이 후 처리하여 분화를 유도
표 Cystic vesicle formation을 유도하며 2일 동안 처리한 결과
표 ARPE19 COA
표 공배양 전 보유한 ARPE19 cell의 특성 분석 결과
표 ARPE19와의 공배양을 통한 시각세포 분화법
표 분화 1, 2, 4주의 시각세포의 특성 분석
표 Flowcytometry 분석
표 시각세포 분화 1주. SPIO 표지 유무에 따른 세포 생존능 및 분화율 비교
표 시각세포 분화 4주. SPIO 표지 유무에 따른 세포 생존능 및 분화율 비교
표 망막시각세포 이식 2주, 4주, 8주, 12주, 20주 후 Dark-adapted 10 ERG측정을 시행하여 b파 진폭을 비교
표 망막시각세포 이식 2주, 4주, 8주, 12주, 20주 후 OKR을 측정
표 각 실험군에서 망막시각세포 이식 1주, 2주, 4주, 12주, 20주 후 조직검사를 시행하여 외핵층의 세포층수를 측정
표 망막시각세포 이식 20주 후 조직 소견
표 좌. 정상 Brown-Norway 랫트의 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI, 우. SPIO 세포표지 된 신경전구체세포(neural precursor cell) 망막하 이식 후 촬영 한 MRI
표 SPIO 표지된 망막세포를 RCS 랫트에 망막하 이식 20주 후
표 좌상. SPIO 입자를 표지한 망막시각세포를 망막하 이식할 경우 SPIO 세포표지된 망막세포를 RCS 랫트에 망막하 이식 다음날 촬영한 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI에서 감소된 신호강도(signal void)가 관찰된다. 이식 2주후 (중상), 4주후 (우상), 8주후 (좌하), 12주후 (중하), 20주후 (우하) 촬영된 MRI에서 감소된 신호강도가 유지되는 것이 관찰
표 좌상. SPIO 입자를 포함한 세포 배양액을 망막하 이식할 경우 SPIO 세포표지된 망막세포를 RCS 랫트에 망막하 이식 다음날 촬영한 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI에서 감소된 신호강도(signal void)가 관찰된다. 이식 2주후 (중상), 4주후 (우상), 8주후 (좌하), 12주후 (중하), 20주후 (우하) 촬영된 MRI에서 감소된 신호강도가 점점 줄어드는 것이 관찰
표 좌. SPIO 세포표지된 망막세포를 RCS 랫트에 망막하 이식 20주 후 촬영된 경우 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI. 9.5 시 방향 중간주변부에 강한 감소된 신호강도(signal void)가 관찰된다. 우. 같은 날 촬영된 안저사진. 9.5 시 방향 중간주변부에 갈색의 SPIO 세포표지된 세포가 관찰
표 상. SPIO 세포표지된 세포를 BN 랫트에 망막하 이식 후 전신 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI를 촬영
표 상. SPIO 세포표지된 세포를 BN 랫트에 망막하 이식 2주 후 촬영된 9.4T T2* 강조 기울기에코 MRI와 안저사진. MRI에서는 감소된 신호강도가 (signal void)가 관찰되나, 안저사진에서는 SPIO 입자의 착색이 관찰되지 않음. 하. SPIO 세포표지된 세포를 RCS 랫트에 망막하 이식 20주 후 촬영된 MRI와 안저사진. 안저촬영 결과 MRI에서 관찰되는 감소된 신호강도와 일치하는 부위에서 SPIO 입자의 착색이 관찰
표 SPIO 표지하지 않은 망막시각세포를 망막하 이식하고 1주일 뒤
표 SPIO 표지된 세포의 망막하 이식 후 조직검사 사진
표 Photoreceptor 이식 후 1주 뒤 생착능 확인
표 Photoreceptor 이식 후 2주 뒤 생착능 확인
표 Photoreceptor 이식 후 4주 뒤 생착능을 확인

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인간 배아줄기세포유래 망막세포를 이용한 망막변성질환 세포치료제 개발
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