초록 ▼

□ 연구개요
▷ 최근 크리스퍼(CRISPR) 시스템의 구성 요소인 Cas9과 가이드 RNA를 진핵세포에 도입하여 유전체 교정에 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있음.
▷ 기존에는 Cas9 단백질과 가이드 RNA의 유전정보를 포함한 DNA를 전달하였으나 유전체 내 비특이적 DNA 삽입으로 인한 변형 문제가 있어 최근에는 재조합 Cas9과 합성 가이드 RNA를 직접 전달하는 방법이 각광받고 있음.
▷ Cas9과 가이드 RNA의 세포 내 전달을 위해서 양이온성 리포좀, 나노 고분자, 세포 투과 펩타이드, 전기천공법 등이

□ 연구개요
▷ 최근 크리스퍼(CRISPR) 시스템의 구성 요소인 Cas9과 가이드 RNA를 진핵세포에 도입하여 유전체 교정에 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있음.
▷ 기존에는 Cas9 단백질과 가이드 RNA의 유전정보를 포함한 DNA를 전달하였으나 유전체 내 비특이적 DNA 삽입으로 인한 변형 문제가 있어 최근에는 재조합 Cas9과 합성 가이드 RNA를 직접 전달하는 방법이 각광받고 있음.
▷ Cas9과 가이드 RNA의 세포 내 전달을 위해서 양이온성 리포좀, 나노 고분자, 세포 투과 펩타이드, 전기천공법 등이 이용되었으나 과정이 복잡하고 세포에 독성을 유발하는 경우가 있어 유전체 교정 효율을 감소시키는 원인이 되기도 함.
▷ 본 연구에서는 세포투과능과 단백질 안정화 기능을 동시가 가진 30Kc19을 이용하여 Cas9을 안정적으로 세포에 전달하고 가이드 RNA와 함께 효과적으로 유전체 변형을 유도하는 기술을 개발하고자 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
< 세부연구목표: 30Kc19이 결합된 재조합 Cas9 단백질의 대량 생산 및 활성 확인 >
▷ 30Kc19과 Cas9의 유전자를 결합하여 클로닝하고 이를 대장균에 전달하여 재조합 융합단백질의 발현을 유도하였음. 발현량을 증대하기 위해 대장균의 배양 조건을 최적화하고 정제공정을 확립하였음.
▷ 30Kc19의 결합이 Cas9의 nuclease 활성을 저해하지 않았음은 물론 다양한 환경에서의 안정성을 향상시켜 활성이 오랫동안 유지되는 것을 확인하였음.
< 세부연구목표: 30Kc19-Cas9 전달을 통한 유전자 변형 및 iPSCs에의 적용 >
▷ 형광단백질인 EGFP를 발현하는 HEK293 세포에 EGFP 특이 가이드 RNA를 전달한 후 30Kc19-Cas9을 처리하였을 때 EGFP의 발현이 특이적으로 감소한 결과를 통해 30Kc19-Cas9 전달에 의한 특이적 유전자 변형을 확인하였음.
▷ 30Kc19-Cas9과 가이드 RNA 복합체를 처리하여 동시에 세포 내 전달을 유도하였을 때 역시 일정 수준의 타겟 유전자 변형이 관찰되었음.
▷ 다만, 인간 유도만능줄기세포(iPSCs)의 경우에서는 유전자 변형 효율이 상대적으로 낮고 그 효과가 일정하지 않아 보강연구를 통해 복합체 전달 프로토콜을 개선 할 필요가 있다고 사료됨.
< 세부연구목표: 단백질 나노입자 생성 및 Cas9/가이드 RNA의 세포 내 전달 >
▷ 30Kc19의 α-helix domain(30Kc19α)를 응집하여 단백질 나노입자를 생성하고 크기, 표면전하 등 물성을 분석한 뒤 이 나노입자의 세포투과능을 확인하였음.
▷ 30Kc19α 나노입자에 효소의 일종인 β-gal을 탑재하여 세포에 처리한 결과, β-gal을 안정적으로 세포에 전달할 수 있었음.
▷ 현재 β-gal 대신 Cas9이 탑재된 30Kc19α 나노입자의 세포 내 전달을 확인중이며 단백질 나노입자를 이용한 Cas9/가이드 RNA 전달법 개발에 활용하고자 함.

□ 연구개발결과의 중요성
▷ 현재까지의 Cas9/가이드 RNA 직접 전달법은 과정이 복잡하고 그 과정에서 활성 및 안정성이 저해되어 생체 내에서와 같이 대상 세포에 전달되기까지 장애물이 많은 경우에서는 유전체 교정 효율이 매우 낮았음.
▷ 본 연구에서 개발한 30Kc19-Cas9은 대장균에서 대량으로 생산되며 추가공정 없이 세포에 바로 전달될 뿐만 아니라 기존 Cas9 대비 안정성도 향상되었음.
▷ Cas9에 세포투과 펩타이드를 결합한 연구들이 있었으나 대장균에서 발현량 저해없이 오히려 안정성을 향상시키면서 세포 전달을 유도한 기술은 없었음.
▷ 본 기술은 30Kc19α 나노입자와 더불어 기존의 Cas9/가이드 RNA 직접 전달 기반 유전체 교정법의 효율을 향상시키는 데 활용 가치가 높을 것으로 기대됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• (1) 연구의 배경 ... 4
• (2) 연구의 최종 목표 ... 4
• (3) 연구의 범위 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
• (1) 30Kc19-Cas9 재조합 단백질의 생산 및 nuclease 활성 평가 ... 5
• (2) 30Kc19-Cas9과 Cas9의 안정성 비교 ... 6
• (3) 30Kc19-Cas9의 세포투과성 확인 ... 8
• (4) 30Kc19-Cas9 전달에 의한 인간 세포의 특정 유전자 변형 확인 ... 8
• (5) Cas9과 sgRNA 전달을 위한 단백질 나노입자 생성 ... 11
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 13
• (1) 연구개발결과의 의미 ... 13
• (2) 연구개발결과의 기대효과 ... 13
• 4. 참고문헌 ... 14
• 5. 연구성과 ... 16
• 대표적 연구실적 ... 17
• 끝페이지 ... 29