초록 ▼

1. 줄기세포 기반 유전자 편집 및 교정 기술에 대한 기존의 기술을 혁신적으로 업그레이드함
가. 유전자 편집에 필요한 시간, 노동력, 비용을 절반 이상 절약

2. 환자유래 체세포에 유전자 치료제와 리프로그래밍 유전자를 동시에 도입하여 유전자 치료된 유도만능줄기세포를 제작하는 기술을 개발함
나. 병리적 유전자에 의한 유도만능줄기세포 제작 및 유지 또는 단일 세포로 유지하는데 한계가 있을 때 근본적으로 병리 유전자를 제거함으로써 안정적인 유도만능줄기세포 제작

3. 최근 이슈가 되는 유전자 편집 도구(

1. 줄기세포 기반 유전자 편집 및 교정 기술에 대한 기존의 기술을 혁신적으로 업그레이드함
가. 유전자 편집에 필요한 시간, 노동력, 비용을 절반 이상 절약

2. 환자유래 체세포에 유전자 치료제와 리프로그래밍 유전자를 동시에 도입하여 유전자 치료된 유도만능줄기세포를 제작하는 기술을 개발함
나. 병리적 유전자에 의한 유도만능줄기세포 제작 및 유지 또는 단일 세포로 유지하는데 한계가 있을 때 근본적으로 병리 유전자를 제거함으로써 안정적인 유도만능줄기세포 제작

3. 최근 이슈가 되는 유전자 편집 도구(CRISPR/Cas9, TALEN)를 활용한 유전자 치료 방법의 단점(유전자 편집이 뛰어난 반면, donor유전자 삽입에 한계가 있음)을 극복하고 Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 벡터를 활용한 치료제를 통해 환자 유래 유도만능줄기세포를 기반으로 파킨슨병 유발 돌연변이 유전자 alpha-SNCA를 치료함
다. CRISPR-Cas9의 경우 효율적인 유전자 편집 기능이 있지만, 편집하고자 하는 부위에 유전자를 대체하는데 여전히 한계가 있음
라. 총 168 kb내에 alpha-SNCA유전자를 포함하고 있는 BAC DNA를 이용하여 상동재조합을 효율적으로 일으켜 유전자 교정 확률을 높여 치료함

(출처 : 요약서 3p)

Abstract ▼

■ Purpose & Contents
1. Purpose
Development of fundamental technology for gene therapy of parkinson’s disease based on reprogramming and genetic manipulation technology

2. Contents
가. Development of fundamental technology for gene therapy
(1) Establishment of gene therapy method t

■ Purpose & Contents
1. Purpose
Development of fundamental technology for gene therapy of parkinson’s disease based on reprogramming and genetic manipulation technology

2. Contents
가. Development of fundamental technology for gene therapy
(1) Establishment of gene therapy method to simultaneously proceed reprogramming and gene correction
(2) Identification of iPSC derived from Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) patient cell
(3) Generation of gene corrected iPSCs derived from patient somatic cells

나. Development of gene correction manner for parkinson’s disease with monogenic mutation
(1) Design & Choice of gene-edition tools, considering nucleotide sequences near mutation residue
(2) Establishment of gene edition tools and providing gene corrected cells for collaborator

(가) Design of TALEN or CRISPER
(나) Customization of Donor template for homology directed repair
(다) Genetically modification of Bacterial artificial chromosome(BAC) vector
(3) Gene correction of PD patient-derived iPSC using modified BAC vector
(가) Generation of iPSC derived from PD patient cells
(나) Modification of BAC DNA harboring LRRK2 or alpha-SNCA gene
(다) Gene correction of PD patient-derived iPSC using modified BAC vector

■ Results
1. Development of fundamental technology for gene therapy
가. Generation of gene edited iPSC by simultaneously combining reprogramming and gene edition tools
(1) Customization of TALEN against Hprt1 gene
(2) Identification of high efficiency of gene-edited iPSC clones generated by one-step manner, combining reprogramming and Hprt1-TALEN
(3) Design of single guided RNA (sgRNA) against Adeno-Associated Virus Integration Site1 as gold standard
(4) Identification of high efficiency of gene-edited iPSC clones generated by one-step manner, combining reprogramming, CRISPER, and donor template

나. Requirement of a simultaneous reprogramming and gene correction process from somatic cells
(1) Identification of iPSC generated from FOP patient cell
(2) Identification of therapeutic limitation of ALK2 R206H-iPSCs
(3) Identification of vulnerability of ALK2 R206H-iPSCs about single cell dissociation

다. Generation of gene corrected iPSC by simultaneously combining reprogramming and gene correction tools
(1) Customization of CRISPER and donor DNA for treating ALK2 R206H

라. Identification of efficiency of gene therapy
(1) Analysis of the rate of both CRISPER-mediated gene edition and homology directed repair of donor DNA
(2) Genotype analysis of gene corrected iPSCs through RFLP
(3) Off target analysis of CRISPER by deep sequencing

마. Identification of effect of gene correction
(1) Analysis of global gene expression pattern
(2) Identification of phenotype rescue through von Kossa staining
(3) Detection of phosphorylated Smads by immunoblotting

2. Development of gene correction tools for treating parkinson’s disease
가. Check mutation residues leading to parkinson’s disease
(1) Design and choice of sgRNA and donor template

나. Manufacture of gene edition tool
(1) Customization of sgRNA against alpha-SNCA A53T or LRRK2 G2019S
(2) Check the efficiency of CRISPER using single strand conformational polymorphism (SSCP)
(3) Design of donor template for homology-directed repair
(4) Generation of iPSCs derived from PD patient somatic cells

다. Gene correction of PD-derived iPSCs using Bacterial Artificial Chromosome-based HR
(1) Modification of BAC DNA harboring alpha-SNCA or LRRK2 gene to confer the resistance for antibiotics (Puromycin or neomycin)
(2) Selection or screening the candidate clones (alpha-SNCA gene corrected clones) showing antibiotics resistance
(3) Removal of antibiotics resistance gene from positive clone by treating flippase recombinase
(4) Acquirement of alpha-SNCA gene corrected iPSCs

■ Expected Contribution
1. Possibility of gene correction for parkinson’s disease
가. Gene correction of LRRK2 G2019S or Parkin Q34R based on the established therapeutic strategy for alpha-SNCA A53T
나. Application for other rare and intractable diseases

2. Expectation of usage of BAC-based HR as therapeutic tool with TALEN or CRISPER

3. One-step gene corrected iPSC, simultaneously using reprogramming and gene correction process
가. To save time, labor, and cost
나. To overcome therapeutic limitation based on iPSCs due to defective gene

(출처 : SUMMARY 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 8
• 목차 ... 9
• 제1장. 연구개발과제의 개요 ... 10
• 1. 연구개발 목적 ... 10
• 2. 연구개발의 필요성 ... 10
• 3. 연구개발 범위 ... 14
• 제2장. 국내외 기술 개발 현황 ... 15
• 제3장. 연구 수행 내용 및 성과 ... 17
• 1. 연구수행내용 방법 및 결과 ... 17
• 2. 연구개발성과 ... 38
• 제4장. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 41
• 1. 목표 달성도 및 기여도 ... 41
• 제5장. 연구개발성과의 활용계획 ... 45
• 1. 추가 연구의 필요성 ... 45
• 2. 연구개발결과의 활용방안 ... 45
• 3. 기대성과 ... 45
• 제6장. 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 47
• 제7장. 연구개발성과의 보안등급 ... 48
• 제8장. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비현황 ... 49
• 제9장. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 ... 50
• 제10장. 연구개발과제의 대표적 연구 실적 ... 51
• 제11장. 기타 사항 ... 52
• 제12장. 참고 문헌 ... 53
• 성과 정보 요약서 ... 54
• 기타 증빙 서류 ... 57
• 끝페이지 ... 58