[보고서]Foxp3 발현 조절을 통한 Treg 세포의 응용

오권익

[국가R&D연구보고서] Foxp3 발현 조절을 통한 Treg 세포의 응용
Clinical application of Treg cells by manipulating the expression of Foxp3 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	한림대학교 HalLym University
연구책임자	오권익
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-11
과제시작연도	2017
주관부처	교육부 Ministry of Education
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201900025159
과제고유번호	1345270630
사업명	개인기초연구(교육부)
DB 구축일자	2020-08-22
키워드	Foxp3.IL2.TET2.IL6.DNMT1.DNA demethylation.stability.TH17.viatmin C.

초록 ▼

□ 연구개요
1. 사전 연구결과 및 가설: Foxp3 CpG (de-)methylation은 ‘IL2-STAT5-Tet'와 ’IL6-STAT3-Dnmt'의 counter-regulation으로 유지됨.
2. 연구 계획
- Foxp3에서 IL2/STAT5/TET와 IL6/STAT3/DNMT의 작용 기전을 밝힘.
- TET inhibitor를 개발하여 면역질환 동물모델에서 면역조절효과를 관찰함.
3. 본 연구의 최종 목표
① Foxp3 유전자 발현 조절을 후성유전학적 수준에서 밝힘
② Foxp3 유전자 발현을 조절할 수 있는 TET 저해제 개발
③ 동물모델에서 저해제의 면역조절 효과를 관찰

□ 연구 목표대비 연구결과
1. CNS2 demethylation에서 IL2-Tet 및 IL6-Dnmt의 작용기전 연구
1-1. Inflammatory cytokines like IL6 cause CNS2 to be methylated in TET2 KO Tregs.
1-2. Foxp3 stability and the suppressive function are impaired in CNS2-methylated TET2 KO Tregs.
1-3. IL2 and vitamin C are required for CNS2 demethylation in vivo.
1-4. IL2 prevents CNS2 re-methylation in a TET-dependent manner.
1-5. TET2 is recruited to the CNS2 locus by IL2 and hinders DNMT1.
1-6. DNA demthylase activity of TET2 is required to maintain CNS2 demethylation
2. 비타민 C에 의한 TH17 분화 기전 연구
2-1. IL17 is upregulated in TH17 cells treated with vitamin C
2-2. TET proteins are not required for the vitamin C-induced IL17 upregulation.
2-3. The effectof vitamin C are abrogated by the knockdown of Jmjd2 histone demethylases.

□ 연구개발결과의 중요성
1. 왜 DNA Foxp3 CNS2 demethylation 연구인가?: 다른 CD4+ T 세포와 비교하여 Treg에 나타나는 가장 specific한 변화이며 Foxp3의 안정적인 발현에 필수적이다. 따라서 CNS2 demethylation을 조절할 수 있으면, Foxp3를 일시적으로 발현하는 활성화된 CD4+ T 세포에서 Foxp3를 안정적으로 발현시킬 수도 있고, Foxp3를 안정적으로 발현하는 Treg에서 Foxp3 발현을 제거할 수도 있다.
2. Tet을 통해 enhancer에서 이루어지는 active demethylation은 아직 자세한 기전이 알려져 있지 않았다. 본 연구팀은 Foxp3 유전자를 모델로 CNS2 enhancer demethylation의 분자적 기전을 연구하였다. 특히 기존의 연구가 'Foxp3 demethylation에서 Tet가 중요하다‘는 것을 밝히는 데 그쳤다면, 본 연구에서는 Tet과 Dnmt의 균형(counter-regulation)을 중심으로 연구를 시행하였고 Foxp3 demethylation에 관한 보다 포괄적인 이해에 도움이 될 것으로 기대한다.

(출처 : 연구결과 요약문 3p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 3
목차 ... 4
1. 연구개발과제의 개요 ... 5
(1) 연구개발의 필요성 ... 5
(2) 연구자가 증명하려 했던 가설 ... 5
(3) 연구 계획 ... 5
(4) 본 연구의 최종 목표 ... 6
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
(1) CNS2 demethylation에서 IL2-Tet 및 IL6-Dnmt의 작용기전 연구 ... 6
(2) Foxp3 CNS2에서 IL2-STAT5-TET2 및 IL6-STAT3-Dnmt1 관계 연구 ... 8
(3) 비타민 C에 의한 TH17 분화 기전 연구 ... 8
3. 연구개발결과의 중요성 ... 9
(1) Foxp3 발현조절 연구가 중요한 이유 ... 9
(2) 본 연구의 중요성 ... 9
4. 참고문헌 ... 9
5. 연구성과 ... 10
끝페이지 ... 12

표/그림 (10)

표 CNS2 demethylation model
표 Tet2 is essential for CNS2 demethylation. Host CD45.1+ mice which received WT or KO Tregs were immunized with Ag and CFA. Donor Tregs were isolated and subjected to CNS2 demethylation assay in 7 days
표 The functions of Tregs is impaired by CNS2 re-methylation. (A) FACS-sorted WT or Tet2−/−Tregs were cultured with anti-CD3/CD28±rIL6 for 4 days. CD4+Foxp3+ cells were re-sorted and used for CNS2 demethylation study. (B) Foxp3+ Tregs isolated from (A) were cultured in the presence of anti-CD3/CD28 + rIL2 and subjected to FACS analysis in 3 days. (C) Cell division dye (cell trace violet)− labeled responder cells were cultured in the presence of various Tregs sorted from (A). The levels of the cell division dye were checked in 3 days. white circles, demethylation; black, methylation
표 IL2 and vitamin C are required to prevent CNS2 re-methylation in vivo. (A-B) WT (A) or Tet2−/− Tregs plus naïve OT-II Tcells (B) were injected into WT mice, which were immunized with OVA/CFA±rIL2/anti-IL2 mAb. CD4+Foxp3+ cells of the donor origin were re-sorted and used for CNS2 demethylation assay
표 IL2 inhibits CNS2 methylation in a Tet-dependent manner. (A, B) FACS-sorted WT and Tet2−/− Tregs were cultured under the indicated conditions and Foxp3+ cells were re-sorted for CNS2 demethylation analysis. (C) FACS-sorted WT and Tet2−/− Tregs were transfected with Tet1/Tet3 siRNAs and the expression levels of indicated gene transcripts were checked by RT-PCR. (D) WT and Tet2−/− Tregs transfected with Tet1/Tet3 siRNAs and cultured under the indicated conditions. Foxp3+CD25+ cells were re-sorted and subjected to bisulfate sequencing
표 Tet2 is recruited to CNS2 and inhibits the binding of Dnmt1. ChIP-qPCR of Tet2 and Dnmt1 at the Foxp3 promoter and CNS2 locus. FACS-sorted WT and Tet2−/−Tregs were cultured in the presence of anti-CD3/CD28 plus rIL6± rIL2, and used for the ChIP analysis. Subsequent qPCR was done on DNA precipitated by anti-Tet2 or anti-Dnmt1 Abs
표 DNA demethylase activity of Tet2 is required to maintain CNS2 demethylation. (A) Tet2−/− Tregs were co-transfected with plasmids encoding WT or mutant Tet2 (myc-tagged) together with siRNAs targeted at Tet1 and Tet3. (B) Tet2−/− Tregs transfected with vector or Tet2 plasmids were cultured under indicated conditions and Foxp3+Myc(Tet2)+ cells were re-sorted for CNS2 demethylation
표 Vitamin C enhances the expression of IL17. (A, B) FACS-sorted naïve CD4+ T cells were cultured in the presence or absence of vitamin C under Th17 (A) or Th (B) polarizing condition and IL17 (A) and IFN-g (B) expression was checked by flow cytometry. (C) Th17 cells were generated in the presence or absence of vitamin C and then, the expression levels of the indicated gene transcripts were checked by RT-qPCR. (D) Percentages of IL17 (left) or RORgt (right)−expressing cells cultured under Th17 conditions in the presence of vitamin C ± sulfinpyrazone (sulifin)
표 Tet proteins were not essential for vitamin C− induced IL17 expression. (A) WT and Tet2−/− naïve CD4+ T cells were transfected with control or Tet1/Tet3 siRNAs and cultured under the indicated conditions. IL17 expression was analyzed by flowcytometry. (B) WT and Tet2−/− naïve CD4+ T cells were transfected with Tet1/Tet3 siRNAs, and the expression of the indicated gene transcripts was checked by RT-PCR. (C) WT and Tet2−/− naïve CD4+ T cells were transfected with control or Tet1/Tet3 siRNAs and cultured under the indicated conditions. IL17+ cells were re-sorted and subjected to bisulfate sequencing
표 Vitamin C worked in a Jmjd2 dependent manner. (A) ChIP-qPCR of H3K9me3 at the IL17 promoter and enhancer (CNS2) locus. FACS-sorted naïve CD4+ T cells were cultured under Th17 conditions in the presence orr absence of vitaminC and used for the ChIP analysis. Subsequent qPCR was done on DNA precipitated by control and anti-H3K9me3 Ab. (B) Quantitative RT-PCR to assess the Jmjd2 expressions. (C) Naïve CD4+ T cells were transfected with control or Jmjd2a/b/c siRNAs. (D) The expression levels of Il17 (left) and Rorc (right) transcripts were investigated. (E) IL17 expressions were checked by FACS. (F) ChIP-qPCR of H3K9me3 at the IL17 promoter and enhancer (CNS2) locus

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