초록 ▼

□ 연구개요
푸마르산, 숙신산, 말산 등의 C₄-디카르복실산은 에너지대사와 생합성경로의 주요한 중간·전구물질임. 여러 미생물들은 각 종마다 차별적으로 확립된 대사경로를 바탕으로 생태계에 존재하는 유기물을 주고받으며 공존함. C₄-디카르복실산 수송단백질은 유기물의 종간 이동에 중추적 역할을 담당함. 본 연구는 (1) 반추위 세균 Actinobacillus succinogenes에서 C₄-디카르복실산 수송에 주요한 역할을 담당하는 수송단백질 DcuB_As

□ 연구개요
푸마르산, 숙신산, 말산 등의 C₄-디카르복실산은 에너지대사와 생합성경로의 주요한 중간·전구물질임. 여러 미생물들은 각 종마다 차별적으로 확립된 대사경로를 바탕으로 생태계에 존재하는 유기물을 주고받으며 공존함. C₄-디카르복실산 수송단백질은 유기물의 종간 이동에 중추적 역할을 담당함. 본 연구는 (1) 반추위 세균 Actinobacillus succinogenes에서 C₄-디카르복실산 수송에 주요한 역할을 담당하는 수송단백질 DcuB_As(현 DcuE)의 기능과 성격을 세포 측정을 통하여 분석하고, (2) 이단백질의 막위상을 실험적으로 결정하여, 결론적으로 A. succinogenes의 C₄-디카르복실산 수송단백질 DcuE의 기능적‧구조적 특성을 규명함을 목표로 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
※ 2015년도 제안서에는 DcuE을 DcuB_As라고 가칭했으나, 본 연구에서 기능을 규명하여 DcuE로 명명하였으므로, 본 최종 보고서에서는 DcuE로 기재함.
(1) DcuE의 기능적 특성 분석→ 연구 완료
- 탄소/에너지원과 성장조건에 따른 A. succinogenes의 글로벌 전사체를 RNA 시퀀싱으로 분석하여 각각의 수송단백질이 발현되는 성장조건에 대한 기초자료를 제작함. 디카르복실산 대사와 관련된 몇 가지 수송단백질을 발견하였고, 이 중 DcuE는 모든 조건에서 구성적 발현을 보여, 기본적으로 중요한 수송체로 파악됨. C4-디카르복실산 수송의 성격을 야생형과 A. succinogenes 균주에서의 분석함.
(2) DcuE가 L-말산/숙신산 역수송체임을 규명→ 연구 완료: 당초 계획했던 “(3)”의 연구를 대체하여 진행됨.
- 원래 푸마르산 수송체라 여겼던 DcuE가 다른 디카르복실산에 비해 L-말산에 대한 친화도와 선호도가 월등히 높고, C4-디카르복실산의 양방향 교환이동(역수송)을 촉매함을 실험적으로 측정함으로써, DcuE의 기능을 규명함.
(3) IHD(Intercalating Hydrophilic Domain)의 기능연구→ 계획대로 실시하였으나 예측과 다르게 결과가 없어서 계획 변경하여 “(2)” 연구로 변경함.
원래 계획에서는 DcuE 단백질상의 특징적인 도메인 IHD연구하기로 했었음. 당초 계획대로 IHD도메인을 제거 및 퓨전하여, IHD의 물질수송기능에 대한 역할 규명실험을 실시했음. 그러나, 수송 기능 및 수송 활성에 아무런 변화가 없었으므로, 이 부분 대신에 위 “(2)”항의 연구로 변경 수행하였음.
(4) DcuE 단백질의 막위상(membrane topology)을 실험적으로 결정→ 현재 진행중.예상보다 많은 시간이 필요하여 후속연구의 필요성이 있음.
DcuE는 12회 이상 막을 관통하는 역수송체로, 기질 결합 부위, 기질 통과 위치 등을 알기 위해서는 막위상을 파악하는 것이 중요함. 1차로 DcuE상 14군데의 위치(세포질/주변세포질/세포막)를 파악하기 위해, 14부위를 lacZ- 그리고 phoA- 로 각각 단백질퓨전(28가지)을 함. 1차 퓨전을 가지고 베타갈락토시다제 및 알칼린포스파타제활성 측정 후, 초안 모델을 작성하고, 여러 in silico 프로그램으로 확인 및 보완하였더니, 추가로 위상를 결정해야 하는 필요성이 생김. 그래서 2차로 다시 9군데의 아미노산위치를 선정하여 위와 같은 단백질퓨전(18가지)를 제작함. 또한 활성측정 방법을서로 다른 두 가지 방법으로 하여 신뢰도를 높임. 당초계획보다 시간이 많이 필요하여, 현재도 꾸준하고 성실하게 실험을 진행하고 있는 중임.

□ 연구개발결과의 중요성
- 숙신산을 포함한 C4-디카르복실산은 석유기반 화학물질을 대체 할 수 있는 유망한 플랫폼 화학 물질임. 이러한 숙신산의 생산을 위하여 기업은 각자의 경쟁력 있는 전략에 따른 시스템을 설계하고 있는데, 그 첫 단계가 생산 균주의 선택이라면, 그주 연구는 이 균주를 유전공학/대사공학/시스템공학에 의해 개량/제어하는 것임.
그런데, 지금까지 숙신산 생산 향상을 위한 많은 시도는 주로 대사효소에 관한 것임.
따라서 기질 흡수 및 생성물 배출을 촉매하는 C4-디카르복실산 역수송체에 초점을 둔 본 연구는 새로운 시도로써 바이오숙신산 생산 효율 향상에 기여하게 될 것임.
- L-말산은 박테리아뿐만 아니라 미토콘드리아를 비롯한 많은 세포 시스템에서 수송또는 셔틀 시스템을 사용하여 세포막을 가로 질러 환원등가물 또는 탄소원을 전달하는 데 결정적인 역할을 함. 본 연구는 L-말산, 푸마르산 및 숙신산을 가역적으로 교환하는 L-말산/숙신산 역수송체 DcuE의 특징적인 메커니즘을 밝힘.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 3
• 가. 개요 및 목표 ... 3
• 나. 균주 A. succinogenes에서 C4-디카르복실산 수송 연구 필요성 ... 3
• 다. 당초 연구자가 계획했던 연구범위 ... 3
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
• 가. 반추세균 A. succinogenes의 전사체 연구와 전세포를 이용한 수송연구 ... 5
• 나. DcuE의 기능규명 ... 8
• 다. DcuE 의 막위상 분석 ... 12
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 17
• 가. C₄-디카르복실산 플랫폼 화학물질 생산에 기여함 ... 17
• 나. 새로운 수송단백질인 L-말산/숙신산 역수송체 DcuE의 기능을 규명함 ... 17
• 4. 참고문헌 ... 18
• 5. 연구성과 ... 19
• 끝페이지 ... 20