초록 ▼

□ 연구개요
최근 제시된 체세포의 배아줄기세포로의 역분화 과정 및 줄기세포의 다양한 세포로의 분화 과정 그리고 세포 유전체 편집 (Genome editing)에서 보듯이 영구적 유전자 발현이 아닌 일시적인 유전자 발현만을 요구하는 세포의 기능/형질/운명 (Fate) 제어 기반 유전자 및 세포 치료법의 필요성이 크게 대두되고 있음. 이에 유전자의 삽입과 발현기간이 최소화된 혁신적인 유전자 전달체 개발이 절실히 요구됨. 본 연구에서는 세포주기에 따라 파괴되는 단백질들과 유전자 삽입을 조절하는 레트로바이러스 단백질 간의 이상적 융합

□ 연구개요
최근 제시된 체세포의 배아줄기세포로의 역분화 과정 및 줄기세포의 다양한 세포로의 분화 과정 그리고 세포 유전체 편집 (Genome editing)에서 보듯이 영구적 유전자 발현이 아닌 일시적인 유전자 발현만을 요구하는 세포의 기능/형질/운명 (Fate) 제어 기반 유전자 및 세포 치료법의 필요성이 크게 대두되고 있음. 이에 유전자의 삽입과 발현기간이 최소화된 혁신적인 유전자 전달체 개발이 절실히 요구됨. 본 연구에서는 세포주기에 따라 파괴되는 단백질들과 유전자 삽입을 조절하는 레트로바이러스 단백질 간의 이상적 융합을 통하여 세포 유전체로의 유전자 삽입능이 최소화되고 단일 세포분열주기 동안만 최단기간 발현될 수 있어 발암 위험성이 완벽히 제거되도록 설계된 스마트 바이러스 유전자 전달체들을 구축, 안전성과 효율이 담보된 그리고 상용화가 용이한 새로운 벡터시스템을 개발하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
* 세포주기 중 특정 단계에서 Ubiquitin-Proteasome System에 의해 분해되며 바이러스와의 융합체 제작에 적합한 세포주기 제어 관여 단백질로서 Cdt1과 Geminin 2종을 선정하였고 해당 단백질에서 분해와 관련된 부분만을 발현할 수 있도록 총 3종의 cDNA를 제작하였음.
* Murine Leukosis Virus (MLV) 단백질 중 유전체 삽입에 관여하는 인테그라제 내부, 37번째, 274번째 아미노산 위치와 N-terminus, C-terminus에 Cdt1 (C91)과 두가지 버전의 Geminin (G60, G110)이 삽입된 융합단백질 발현용 유전자를 합성하였음.
* 분해를 목적으로 최소화된 Cdt1 (1종) 또는 Geminin 단백질 (2종)이 인테그라제 여러 위치에 삽입된 변종 MLV 벡터 총 15종과 Wild-type 인테그라제가 탑재된 벡터 1종을 생산함.
* 변종 벡터의 감염능을 평가하였으며 Wild-type 보다 감소하였지만 유전자치료 및 세포 기능/형질/운명 조절로의 적용에 충분한 수준의 감염능을 얻었음.
* 바이러스 유전체 내에 eGFP 유전자 도입을 통하여 벡터로 전달된 유전자 발현의 단기/중기 동력학적 특성을 분석하였으며 이로부터 인테그라제 내부에 Cdt1과 Geminin이 도입된 경우에만 특별히 유전자가 단기 발현됨을 확인하였음.
* 형광유전자가 오직 단기 발현되는 것으로부터 Cdt1과 Geminin이 도입된 경우 세포 유전체로의 바이러스 유전체 삽입이 일어나지 않음을 확인하였고 추가적으로 바이러스 유전체 내에 Puromycin 저항 유전자를 삽입한 경우에도 변종바이러스의 경우만 약제에 저항성을 보이는 세포 군집이 거의 생성되지 않음으로부터 유전체 삽입능이 거의 완벽하게 제거됨을 확인함.
* 동일 세포 내 2개의 형광단백질 유전자 전달이 가능함을 보임으로써 개발된 벡터가 2개 이상의 유전자 전달을 통해 세포 기능/형질/운명 조절로의 적용이 용이함을 확인하였음.
* iPS 유도용 유전자들과, 세포 유전체 편집용 CRISPR-Cas9 system 유전자들이 포함된 바이러스 유전체 플라스미드를 제작하였고 이 유전자들이 탑재된 변종 벡터를 생산하였음. 원 계획에는 없지만 세포 자살을 유도하는 유전자가 탑재된 변종 벡터도 추가 생산하였음.
* 구축된 벡터를 이용 iPS를 유도하였고, 세포 유전체를 편집하여 그 결과로 유전체상에 존재하던 eGFP 유전자가 파괴됨을 확인하였으며 자살유전자를 통해 세포가 사멸함을 확인하였음. Wild-type 벡터의 경우 유전체 삽입으로 지속적인 Off-target 유전체 절단과 세포 사멸이 일어났지만 변종 벡터를 사용한 경우 유전체 삽입이 없어 이와 같은 문제가 크게 약화되었음.

□ 연구개발결과의 중요성
* 개발된 발암 가능성이 완전히 제거된 지능형 유전자 전달시스템은, 유전체 편집, 체세포의 배아줄기세포로의 또는 성체줄기세포로의 부작용 없는 역분화, 다양한 유전자 스위치 조절을 통한 신경줄기세포의 분화제어 등에 적용 가능하며 세포의 유전체, 형질, 기능 및 운명 전환에 기반한 혁신적 세포치료 기법개발에도 큰 도움이 될 것임.
* 제안된 아이디어와 연구방법은 향후 다양한 레트로바이러스 및 렌티바이러스 시스템에 확대 적용 또는 활용할 계획으로 전반적인 레트로/렌티바이러스에 기반한 유전자 치료용 벡터의 안전성을 높여 그 의학적 활용 범위를 크게 넓힐 것으로 예상함.
* 본 연구에서 구축된 세계 최고 수준의 안전성이 보장된 벡터 시스템을 기본 구조로 유전자 전달체 및 유전자 제어용 Molecular tool 제품들을 개발, 상용화하고자 함. 국내 관련 기업들과도 논의 예정임.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
• 2-1) 최적 세포주기제어 관여 단백질 선정 ... 4
• 2-2) 인테그라제 내 적합한 융합 위치 선정 ... 4
• 2-3) 레트로바이러스 감염능 향상을 위한 Cdt1 및 Geminin 단백질의 Deletion mutant 구축 ... 5
• 2-4) 인테그라제와 Cdt1 및 Geminin 단백질의 융합체 발현을 위한 유전자 합성 ... 5
• 2-5) 변종 MLV 벡터 생산 ... 5
• 2-6) 돌연변이 벡터의 세포 감염능력 분석 ... 6
• 2-7) 감염세포 장기 배양 및 유전자 발현 동력학적 (dynamic) 분석 ... 6
• 2-8) Drug resistant 세포군 (Cell colony) 발생 관찰 ... 6
• 2-9) 변종 벡터를 이용 동일 세포 내 2개 이상의 외부 유전자 전달 ... 7
• 2-10) 변종 벡터들의 세포 유전체/형질/운명 조절로의 적용을 위한 바이러스 유전체 플라스미드 구축 ... 8
• 2-11) 변종 벡터의 세포 유전체/형질/운명 조절 적용 ... 8
• 3. 연구개발 결과의 중요성 ... 8
• 4. 참고문헌 ... 9
• 5. 연구성과 ... 9
• 끝페이지 ... 9