초록 ▼

연구의 목적 및 내용
ㅇ 퇴행성 뇌질환을 α-synuclein을 분열효모 유전자결실 라이브러리에 도입한 후 독성기작을 규명하고자 함
ㅇ ALS(루게릭질환)는 여러 원인 유전자가 관여하는 복합적 질환으로 본 연구에서는 원인 유전자 중 하나인 TDP-43 (TAR
DNA-binding protein 43)의 세포내 독성을 조절하는 분자표적을 발굴하여 치료제 개발 기여하고자 함
ㅇ 인간의 비알콜성 지질대사질환 원인유전자 중 하나인 SREBP (Sterol regulatory element-binding protein

연구의 목적 및 내용
ㅇ 퇴행성 뇌질환을 α-synuclein을 분열효모 유전자결실 라이브러리에 도입한 후 독성기작을 규명하고자 함
ㅇ ALS(루게릭질환)는 여러 원인 유전자가 관여하는 복합적 질환으로 본 연구에서는 원인 유전자 중 하나인 TDP-43 (TAR
DNA-binding protein 43)의 세포내 독성을 조절하는 분자표적을 발굴하여 치료제 개발 기여하고자 함
ㅇ 인간의 비알콜성 지질대사질환 원인유전자 중 하나인 SREBP (Sterol regulatory element-binding protein)라는 막단백질인 SREBP의 N-term part(전사핵심 부위)가 Golgi에서 어떻게 잘려 활성화 되는지를 규명하여, 신규 항진균제 개발에 기여하고자 함

연구개발성과
▶ α-synuclein 세포 독성 조절인자 발굴 및 NGS기반 스크리닝 시스템 구축
ㅇ α-synuclein(α-syn.)에 의한 독성을 조절하는 specific modifier(suppressor or enhancer)를 찾기 위해서 3,200종의 분열효모 haploid균주에 α-syn.을 발현 후 Microarray 및 NGS로 분석. NGS 및 chip based microarray 분석결과를 가지고 GO분석을 한 결과, TOR signaling cascade, Transport categories가 상위후보군으로 나오는 결과를 얻을 수 있었음. 상위 150개의 유전자 중 cdc11, tco89, rec11, pmo25, smb1 등의 유전자가 TOR signaling categories에 포함됨을 관찰
ㅇ vps17, Sft1, Smb1 등의 결실 유전자에서 wild type 에 비해 독성효과가 크게 나타나는 것을 발견. vps17과 linkage를 이루는 5종(stc1, mug186, vps5, vps29, vps26)과 sft1과 linkage를 이루는 2종(stc1, gos1)을 발견
▶ TDP-43 세포내 독성 조절인자 발굴 및 NGS기반 스크리닝 시스템 구축
ㅇ TDP-43에 의한 독성을 조절하는 specific modifier(suppressor)를 찾기 위해서 3,200종의 분열효모 haploid균주에 TDP-43을 발현 후 Microarray 및 NGS로 분석, data의 정확도를 이기 위해 각각 streaking을 통하여 manual screening을 수행하여 재 검증하였음. 1차 결과, 총 80종의 TDP-43 suppressor 후보군을 선별하였음
ㅇ 80종의 후보군을 대상으로 GO-analysis 결과, vesicle-mediated transport, histone H3-K4 methylation, covalent chromatin modification 등 categories가 상위후보군의 결과를 얻음
ㅇ 후보군으로 선정된 80 종의 결실 유전자중 eukaryotic-conserved genes 만을 선별하여 50종을 대상으로 2차 spotting assay를 수행하였음. Wild type(WT)에 비해 독성효과가 크게 줄어드는 결실 유전자 GTP ase Rbg1, COMPASS complex swd2, Ubp16, Vps8, P lc1 등을 포함한 12종을 선별 함
ㅇ TDP-43 mutants form(Q331K)에서도 동일하게 screening을 진행하였으며, 44종의 후보군을 탐색하였음. TDP-43 WT screen에서 발굴하지 못한 5종의 후보군을 추가로 탐색하였으며 모두 겹치는 후보군은 17종으로, TDP-43 suppressor gene을 효모 모델을 통해 최초로 발굴
▶ 꼬마선충(C. elegans)에 적용하여 검증 및 작용기작 연구
ㅇ 분열효모에서 선별한 후보군 17종을 대상으로 orthologous gene을 선별. TDP-43 over-expression transgenic(Tg) worm에 각각의 유전자를 knock-down 하는 RNAi feeding methods를 적용. 각각의 유전자가 knock-down 되었을 때, 나타나는 phenotype을 movement assay, attractant assay를 통해 worm의 운동성 회복정도를 파악
ㅇ 후보군 중, GTPase Rbg1, COMPASS complex Swd2, ubiquitin C-terminal hydrolase Ubp16 유전자를 knock-down 시켰을 때, TDP-43 Tg worm의 control에 비해 운동성이 좋아짐을 규명함으로서 효모모델에서 찾은 suppressor가 꼬마선충에서도 작동함을 최초로 증명
▶ 꼬마선충 결과를 인간세포주를 이용하여 재 검증
ㅇ swd2, vps20, rbg1, sir2, ubp16 5종의 유전자를 knock-out시켰을 때 선충 결과와 동일하게 TDP-43독성을 감소시키는 것을 발견
▶ 분열효모의 SREBP인 Sre1 활성조절인자 발굴
ㅇ 혐기조건과 유사혐기조건(YES+CoCl2)에서 생장이 민감한 균주들 발굴
- 혐기조건과 유사혐기조건에서 민감한 33종 후보 균주들 1차로 선별 후,
- 이들을 다시 혐기조건과 유사혐기조건에서 Sre1N에 의해 생장이 recovery 되는 4종의 ssh1(SPBC19G7.17), scp1(SPBC3B9.15c), rbd2(SPCC790.03), hem14(SPAC1F5.07c) 유전자가 결손된 균주들을 선별함.
ㅇ 발굴된 민감 유전자인 rbd2가 Sre1의 활성을 조절함을 최초 규명
-Sre1 공정과정에 key역할 하는 Rbd2의 주요 잔기 발견(S130, H182)

연구개발성과의 활용계획(기대효과)
▶ 본 연구를 통해, 질환연구 모델로써 분열효모-선충 간 상호 보완 연구 전략이 유효함 입증. 이 전략은 기존의 분자생물학적 방법으로 예측하지 못하는 신규 조절경로를 진화유전학적 접근법으로 발굴하는데 유용

(출처 : 요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• 목차 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 연구수행내용 및 성과 ... 7
• 제 1절 α-synuclein 세포 독성 조절인자 발굴 및 NGS기반 스크 ... 7
• 제 2절 TDP-43 세포내 독성 조절인자 발굴을 위한 setup 실험 ... 13
• 제 3절. 분열효모 이용 TDP-43 세포내 독성 조절인자 발굴을 위한 TDP-43 suppressor HTS 수행 ... 17
• 제 4절 선충 모델 적용 TDP-43 suppressor 검증 ... 31
• 제 5절 인간세포주 TDP-43 suppressor 검증 (1) ... 44
• 제 6절 OPTN 세포내 독성 조절인자 발굴을 위한 OPTN suppressor HTS 수행 ... 57
• 제 7절 분열효모의 SREBP인 Sre1 활성조절인자 발굴 ... 68
• 3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 94
• 4. 연구개발성과의 활용 계획 등 ... 96
• 붙임. 참고문헌 ... 96
• 붙임. 수정 보완 의견 ... 97
• 끝페이지 ... 99