[보고서]인간 전분화능 줄기세포로부터 고 기능성 간세포로의 대량 분화유도 원천기술 개발 및 조직재생인자 발굴

김종훈

[국가R&D연구보고서] 인간 전분화능 줄기세포로부터 고 기능성 간세포로의 대량 분화유도 원천기술 개발 및 조직재생인자 발굴
Derivation of functional hepatocytes and identification of tissue regenerating factors by guided differentiation of human pluripotent stem cells 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	고려대학교 Korea University
연구책임자	김종훈
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2017-04
과제시작연도	2016
주관부처	미래창조과학부 Ministry of Science, ICT and Future Planning
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201900027383
과제고유번호	1711038420
사업명	바이오.의료기술개발
DB 구축일자	2020-09-19
키워드	인간배아줄기세포.분화.간세포.간질환.조직재생.Human embryonic stem cell.Differentiation.Hepatocytes.Liver disease.Tissue regeneration.

초록 ▼

기 보유 간세포 분화 프로토콜을 개선함으로서 생산 수율을 높이기 위한 간전구세포 증폭단계를 포함하는 분화기법 개발에 성공(생산 수율 >3)하였음. 분화 간세포의 기능성을 증진시키기 위한 최종 분화단계 최적화 (배양액 조성 변경 및 신규 분화인자 발굴 및 추가)을 통하여 약물대사 활성을 2배 이상 높이는 분화유도기법을 확립하였음 (논문게재: Toxicological Sciences 등 / 특허 출원: 1) 고기능성 간세포의 분화방법 10-2015-0113616, 2) 간세포의 약물대사 기능 향상방법 10-2015-0114352 / 기술이전 완료 2016, 10, 17)
줄기세포 및 분화 간세포가 분비하는 세크레톰의 급만성 간질환에 대한 치료적 효용성을 검증하고, 분비 단백질들 중 간경화를 완화시키는데 핵심적인 치료효능을 보이는 단백질 발굴에 성공하였으며, 관련 연구결과를 소화기계 세계 최고학술지에 출판완료 하였음. (논문게재: Gastroenterology, IF=18.19 / 특허출원: MFG-E8을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물, 국내 10-2015-0106532, 국제 PCT/KR2016/007611 / 기술이전 완료 2016. 10, 17: 기술양도, 기술료 4억 징수 완료)

(출처 : 보고서 요약서 3p)

Abstract ▼

□ Purpose & Contents
The purpose of this project is to optimize the protocol for differentiating hESCs toward hepatocytes with high physiological functions and to discover a new tissue regenerating factors secreted from differentiated hepatocytes
● To develop an optimized protocol to produce mass-scale of hESC-derived hepatocytes
● To analyze the molecular mechanism of tissue regeneration induced by grafted hESC-derived hepatocytes and their secretomes in animal models of acute and chronic liver diseases
● To identify a new tissue regenerating factors in secretomes of hESC-derived hepatocytes
1) Optimization of protocol for differentiating hES cells toward functional hepatocytes at massive scale
○ Development of effective expanding and cryo-preserving system for hepatic progenitors
○ Discovery of new regulating factors in hepatic differentiation using systems biology analysis
○ Optimization of protocol for enhancing physiological functions of hESC-derived hepatocytes
2) Analysis and potentiation of multiple functions of hESC-derived hepatocytes
○ Comparative analysis of gene/protein expressions at each steps of hepatic differentiation
○ Verification of physiological and biochemical function of hESC-derived hepatocytes
○ Analysis of metabolic pathway and transcriptional regulatory module of hESC-derived hepatocytes
3) Identification of new therapeutic factors for tissue regeneration in secretomes derived from hESC-derived hepatocytes
○ Establishment of acute and chronic liver-disease animal models for studying mechanism of tissue regeneration after cell and secretome injection
○ Study for functional engraftment into injured liver tissues and evaluation of potential health risk of transplanted hESC-derived hepatocytes in vivo
○ Protemoic analysis of secretomes obtained from hESC-derived hepatocytes
○ Identification of tissue regenerating candidate factors via proteomic and systems biology analysis
4) Understanding physiological and molecular mechanisms of tissue regeneration by treating hESC-derived hepatocytes and their secretomes
○ Establishment of a hypothesis of tissue regeneration by investigating responses of injured liver tissue to grafted hepatocytes and their secretomes at the level of transcriptional networks.
○ Identification new tissue-regenerating factors by comparing secretome analysis and host tissue responses.
○ Study for the underlying mechanism of identified and discovered new factors in liver tissue regeneration

□ Results
Optimization of hepatic differentiation & Identification of anti-fibrotic protein in stem cell secretome
○ Achievement #1: Optimization of hepatic differentiation
Optimization of the differentiation protocol for generating functional human hepatocytes that includes the step of amplifying the number of hepatic progenitors and the step of enhancing metabolic activities of drugs (Yield, >3; AVE metabolic activity, >2)
○ Achievement #2: Characterization of stem cell-derived hepatocytes
Verification of the therapeutic potential of resulting human stem cell-derived hepatocyte in vitro and in vivo by analyzing phenotypes and expressions of marker genes & proteins, and by grafting into animal models with acute and chronic liver diseases.
○ Achievement #3: Validation of therapeutic effects of stem cell secretome
Demonstration of the beneficial effects of secretome released from stem cells and stem cell-derived hepatocytes in the animals with acute and chronic liver injuries without cell grafting.
○ Achievement #4: Identification of anti-fibrotic protein in stem cell secretome
Identification of MFG-E8 as a key therapeutic protein in the secretome and verification of the therapeutic effects of MFG-E8 in animals with liver fibrosis.

□ Expected Contribution
○ The patents involving the above achievements have been transferred to a company. Thus, together with the company, our team will develop and produce the commercial products of human stem cell-derived hepatocytes. In addition, regarding the MFG-E8 protein, we’ll focus on the investigation on the mechanism of action and obtain data for the preclinical GLP safety study.

(출처 : SUMMARY 6p)

목차 Contents

표지 ... 1
제출문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
국문 요약문 ... 4
SUMMARY ... 6
CONTENTS ... 8
목차 ... 9
제1장. 연구개발과제의 개요 ... 10
1절. 연구개발 목적 ... 10
2절. 연구개발의 필요성 ... 10
3절. 연구개발 범위 ... 15
제2장. 국내외 기술 개발 현황 ... 16
1절. 세계적 수준 ... 16
2절. 국내 수준 ... 17
3절. 국내외 연구 현황 ... 18
4절. 관련 시장동향 ... 21
제3장. 연구 수행 내용 및 성과 ... 22
1절. 1차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 22
2절. 2차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 61
3절. 3차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 91
4절. 4차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 106
5절. 5차년도 연구수행 내용 및 결과 ... 131
제4장. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 143
1절. 연구개발의 최종목표 ... 143
2절. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 143
3절. 계획대비 달성도(선정 시 제시된 연구목표) ... 145
4절. 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4∼5개 목표 추출 및 가중치 부여 ... 149
제5장. 연구개발성과의 활용계획 ... 150
제6장. 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 ... 152
제7장. 연구개발성과의 보안등급 ... 155
제8장. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 156
제9장. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 ... 157
제10장. 연구개발과제의 대표적 연구 실적 ... 161
제11장. 기타 사항해당사항 ... 163
제12장. 참고 문헌 ... 164
끝페이지 ... 167

표/그림 (111)

표 Wnt3a 와 BMP4 처리하며 3D로 간세포로 분화시 세포 순도 조사
표 기 보유 간세포 분화 과정에서 간세포 특이적 유전자 발현 조사
표 높은 효율의 분화 간세포를 얻기 위한 기 보유 간세포 분화 프로토콜 개선 모식도
표 면역형광염색과 유전자 발현 조사를 통한 기 보유 간세포 분화 프로토콜 적합 기본 배지 조사
표 간세포 분화 과정에서 리튬 처리에 의한 간세포 특이적 유전자 발현 조사
표 간세포 분화 과정에서 리튬 처리 할 때 ROCK inhibitor처리에 의한 세포 변화 관찰
표 간세포 분화 과정에서 리튬 처리 시 간세포 특이적 유전자 발현의 증가 확인
표 간세포 분화 과정에 따른 간 전구세포 마커를 면역형광염색으로 확인
표 개선한 간세포 분화 프로토콜의 각 단계별 간세포 특이적 유전자 발현 조사
표 분화시킨 간세포의 기능검사를 위해 PAS 염색 진행
표 개선된 간세포분화 프로토콜로 분화시킨 간세포에 DMSO 처리 후 간세포 활성을 유전자 발현조사를 통해 분석
표 분화시킨 간세포의 유전자 발현을 비교해서 Gene ontology 네트워크로 확인
표 Downregulation genes
표 Upregulation genes
표 효율적인 간 전구세포 동정을 위해 개선한 신규 간세포 분화 프로토콜의 모식도
표 신규 간세포 분화 프로토콜을 통해 분화시킨 간세포의 특성을 면역형광염색을 통해 확인
표 신규 간세포 분화 프로토콜에서 간 전구세포 특이적 마커를 이용한 간 전구세포의 분리
표 간 전구세포의 분리 동정 후 해동시켜 간세포의 기능성 확인
표 간 전구세포의 분화효율을 높이기 위해 간세포 특이적 유전자 발현 조사를 통해 간세포 분화 프로토콜 개선
표 간세포 특이적 유전자 발현 조사를 통해 간 전구세포 분화에 효율적으로 간세포 분화 프로토콜 개선
표 분화시킨 간세포의 세크레톰 내 분비단백체 분석
표 분화 간세포 세크레톰 내 단백질 기능 분석의 재현성 확인
표 GeneGo software를 통해 단백체 네트워크 조사
표 ECM remodeling 의 canonical pathway 확인
표 Gengo software를 통해 regenaration 에 관여하는 11개의 후보 단백질 확보
표 Gengo software를 통해 regenaration 에 관여하는 20개의 Transcription Factor 후보 확보
표 Gengo software를 통한 세크레톰 분석의 신뢰성을 PCR로 확인
표 ICGhighCM에서 동정한 단백질이 조직재생 기전에 관여함을 확인
표 In vivo에서 알젯 삼투압 펌프를 이용한 세크레톰 주입 프로토콜 확립
표 만성간염 쥐 모델에서 세크레톰 주입에 의한 조직재생 능력 확인
표 만성간염 쥐 모델에 세크레톰 주입 후 일차별 Cholesterol concentration과 Triglyceroid concentration을 ELISA assay 방법으로 확인
표 CCl4 처리 만성간염 쥐 모델의 Lipidosis를 H&E 염색과 Oil red O 염색으로 확인
표 CCl4 처리 만성간염 쥐 모델에 ICGhighCM 주입 후 조직재생 효과를 Sirius red 염색으로 확인
표 Proteomics를 이용해서 조직 재생능 비교 모식도
표 급성 간염 쥐 모델에서 ICGhighCM 주입 후 간기능검사 진행
표 CCl4를 처리하여 만든 간염 쥐 모델에 ICGhighCM 주입 후 Cholesterol concentration과 Lipid peroxidase concentration을 ELISA assay 방법으로 확인
표 조직 재생능 분석을 위해 In vivo 실험군 단백질 동정 성공
표 Acute liver disease model의 liver tissue에서 단백질 동정 결과 분석 (ICGhighCM-injected 그룹에서 Normal 그룹의 Biology process와 거의 유사)
표 Acute liver disease model의 liver tissue에서 단백질 동정 결과 분석 (ICGhighCM-injected 그룹에서 Normal 그룹의 Cellular component와 거의 유사)
표 Acute liver disease model의 liver tissue에서 단백질 동정 결과 분석 (ICGhighCM-injected 그룹에서 Normal 그룹의 Molecular function이 거의 유사)
표 Acute liver disease model의 liver tissue에서 단백질 동정 결과 분석으로 간 재생 관련 단백질 확보
표 GeneGO software의 ‘Process Networks’을 이용하여 분석 한 결과 ICGhighCM-injected 그룹의 간 재생 관련 인자 확인
표 Acute liver disease model의 liver tissue에서 ICGhighCM 처리 그룹의 유전자 발현 조사
표 간 전구세포의 존재시기 모니터링을 위한 벡터 디자인
표 간 전구세포 표지자인 AFP promoter 포함하는 벡터 디자인
표 간 전구세포 표지자인 AFP promoter 포함하는 벡터 제작 과정 모식도
표 pAFP-AcGFP vector의 GFP 발현 확인
표 세 가지 세포주에서 pAFP-AcGFP를 transfection후 GFP 발현 확인
표 pAFP-AcGFP transfection에 적합한 Lipofectamine 검증
표 Lipofectamine 3000 처리 시 DNA양에 따른 GFP positive 세포의 변화 관찰
표 간 전구세포로 분화시킨 후 pMAX-GFP와 pAFP-AcGFP를 각각 transfection한 뒤 GFP 발현 확인
표 성숙 간세포 정제를 위해 Indomonocarbocyanine을 이용한 FACS 진행
표 저분자 물질을 이용한 간 전구세포 분화 방법 확립 모식도
표 리튬을 이용한 간세포 분화 프로토콜에서 분화 과정에 따른 유전자 발현 조사
표 리튬을 이용한 간세포 분화 프로토콜에서 분화 과정에 따른 간세포 특이적 마커의 발현을 면역형광염색을 통해 조사
표 저분자 화합물을 이용한 간세포 분화 방법 과정에 따른 세포 모양 변화와 유전자 발현 조사
표 간세포 분화기법을 통해 분화시킨 간세포의 간세포 특이적 유전자 발현 조사 및 FACS 진행
표 간세포 분화 과정 중 마지막 단계에서 간세포 특이적 유전자 발현 및 단백질 발현 조사
표 PCR array를 통해 분화된 간세포에서 약물대사에 관여하는 효소 발현 조사
표 ] 미분화인간배아줄기세포와 인간태아 간세포의 간세포 특이적 효소의 발현을 유전자 수준에서 PCR array를 통해 확인
표 본 연구기관에서 보유하고 있는 간세포 분화 방법을 통해 분화시킨 간 전구세포와 간세포에서 면역형광염색 실시
표 역분화 줄기세포을 본 연구진이 보유한 간세포 분화 방법을 이용해 간세포로 분화시킨 후 면역형광염색 시행
표 본 연구진이 보유한 간분화 방법으로 분화시킨 간세포의 기능성을 LDL uptake, PAS, ICG 염색으로 확인
표 Mouse primary hepatocyte와 최적화된 분화기법을 이용해서 분화시킨 간세포의 약물대사능력 비교
표 간세포 분화 과정에 따른 mRNA Sequencing을 통해 시스템생물학적 분석 시행
표 Acute liver disease model에 CM 주입 후 조직재생 메커니즘 분석 모식도
표 Acute liver disease model에 CM 주입 후 MPP software로 통계분석 시행
표 Acute liver disease model에 CM 주입 후 Gengo software를 통해 간세포 재생 및 증식에 관여하는 전사조절인자 선별
표 Acute liver disease model에 CM 주입 후 선별된 TF의 유전자 발현 조사
표 확보한 TF의 네트워크 분석
표 확보한 TF를 통해 찾은 12개의 target protein의 발현 확인
표 확보 된 12개의 간재생 관련 target protein 의 기능적인 분석을 네트워크를 통해 확인
표 간 전구세포 단계에서 분화 간세포 기능성 향상을 위한 간세포 구체 형성
표 본 연구팀에서 고안한 삼차원 배양 기법으로 분화한 간세포의 약물대사 능력을 유전자 발현 수준에서 비교
표 분화 간세포를 이용한 삼차원적 간 독성 모델 확립 후 간세포의 기능성 확인
표 삼차원적 배양으로 분화한 간세포의 간독성 약물대사 효소 발현 확인
표 분화 간세포의 약물대사 능력 향상을 위한 물질 처리 후 약물대사 관련 효소의 유전자 발현 조사
표 간 조직재생능력 확인을 위한 마우스 모델 확립
표 만성 간질환 유도 마우스 모델의 간 손상 정도를 Sirius Red 염색을 통해 확인
표 만성 간질환 유도 마우스 모델의 간 섬유화 정도 확인
표 간질환 모델 마우스에 이식한 분화 간세포의 생착능 확인
표 간질환 모델 마우스에 분화 간세포 이식시 사용 가능한 새로운 표지자 확인
표 새로 개발한 분화 간세포 표지자를 이용한 마우스 조직의 세포 안정성 확인
표 급성 간질환 모델에 중간엽 줄기세포 이식 후 간기능성 검사
표 급성 간질환 모델에 분화 간세포 이식 후 조직 재생능력을 면역형광염색을 통해 분석
표 간질환 모델에 분화 세포 분비 단백체 주입 시 조직 재생능력 조사
표 만성 간질환 모델에 세포 분비 단백체 주입 시 간질환 개선 효과 검사
표 본 연구진의 기보유 간세포 분화 프로토콜의 단계를 그림 (A)로 간단하게 표현함. 본 연구진의 기보유 간세포 분화 프로토콜을 이용해 인간배아줄기세포로부터 간세포로 분화시킨 세포의 간세포 특이적 인자 발현을 real-time PCR 로 확인한 결과 (B) AFP 와 (C) ALB 와 (D) NTCP 의 발현 비교를 통해 DMEM media 사용 시 간세포 특이적 인자의 발현이 증가함을 확인함
표 본 연구진의 기보유 간세포 분화 프로토콜을 이용해 간세포 성숙단계에 다양한 조합의 재생촉진인자 처리 후 유전자 발현을 real-time PCR로 확인. (A) AFP 와 (B) ALB 의 발현 비교를 통해 DEX 처리 시 간세포 특이적 유전자 발현이 증가함을 확인
표 본 연구진의 기보유 간세포 분화 프로토콜을 이용해 수획한 secretome의 프로테오믹스 분석으로 얻은 재생촉진 인자 후보인 여러 종류의 ECM 단백질 처리 후 유전자 발현을 real-time PCR로 확인. (A) AFP 와 (B) ALB, (C) NTCP 의 발현 비교를 통해 ECM 재생촉진후보 인자 중 laminin이 가장 유효함을 확인함
표 프로테오믹스 분석을 통한 분화된 간세포 배양액의 단백체 동정 (A) 분리된 간세포에서 356개의 분비단백질을 동정하였고, 그 중 특이적인 단백질 150개를 확인함. 206개의 공통된 단백질 중 2배 이상 차이나는 단백질을 62개 더 추가함. 따라서 총 212개의 단백질을 동정함. (B) Dante R software을 이용하여 2배 정도 차이가 나는 분비 단백체들끼리 clustering 을 한 heat-map 분석
표 GeneGo software를 통해 시행한 분리된 분화 간세포의 분비 단백체의 기능 분석. (A) ‘GO process’내 분리된 분화 간세포의 가장 높은 기능으로 ‘Tissue remodeling and wound repair’의 결과를 얻음. (B) 앞선 결과를 세분화하여 분석한 결과 ‘Cell adhesion_ECM remodeling’에 관여하는 단백질이 많음을 확인하였음
표 분리된 분화 간세포의 분비단백체 중 조직 재생 단백질에 관련되어 추출된 후보인자. Tissue development에서 43개, Wound Healing에서 18개, Tissue developmental growth에서 8개, Cell regeneration related proteins에서 12개의 후보인자를 추출하였음
표 미분화 중간엽 줄기세포와 중간엽 줄기세포 유래 분화 간세포의 배양액 단백체 동정 (A) 미분화 중간엽줄기 세포에서는 668개, 분화 간세포에서는 794개의 분비단백질이 동정되었고, 그 중 139개의 공유 단백질을 분석하였음. (B) 139개의 공유 단백질 중 분화 간세포에서 유의성 있게 증가한 32개의 조직 재생에 관련된 효과를 가진 후보 물질을 선정하였음
표 인간 전분화능 줄기세포와 중간엽 줄기세포로부터 분화된 간세포 배양액의 조직 재생 능력 효과 확인 (A) 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 간세포 배양액의 효과를 H&E, sirius red, lipidosis확인을 통해 확인함. (B) 중간엽 줄기세포로부터 분화된 간세포 배양액의 효과를 H&E, sirius red, Masson’s trichrome (MT), α-SMA, F4/80의 형광염색을 통해 확인함
표 조직 재생에 관여하는 후보 물질의 네트워크. (A) Decorin이 조직 재생 인자와 이루는 네트워크. (B) PEDF 가 조직 재생 인자와 이루는 네트워크
표 분화 간세포에서 분비된 단백질에 의해 조직 내 재생을 유도하는 전사인자. 가장 유의성 있는 전사인자인 SP1, AP1, HNF4-alpha, CEBP-beta를 선정하여 어떤 분비 단백체와 연관되어 있는지 나타낸 그림
표 조직재생인자 후보물질 10종 내외
표 NIR spectrometer 상에서 여러 가지 용매에 dissolved 된 대조군 ICG와 개발된 생체 내 이식한 분화된 간세포 이미징 및 추적 표지자 X가 거의 유사한 780~800nm의 파장대를 띠고 있음을 확인함
표 간세포 분화 마지막 단계에서 농도별로 개발된 X를 처리한 결과, PBS와 culture media와 대조시, 확연히 분화된 간세포들이 dose-dependent하게 발색이 되고 있음을 육안으로 확인하였음. 이를 DMSO-dissolved cells을 multi-spectrometer기에 넣고 785~800nm NIR 파장대를 확인함
표 개발된 X로 표지된 분화된 간세포를 이식한 한 마우스. 96h까지 생체 이미징 검증함. Ex-vivo 이미징에서 세포가 이식된 간에서만 NIR 파장을 확인할 수 있었고, cryosection한 간조직에서도 이식된 간세포 확인됨. (빨간색: Albumin, 파란색: DAPI)
표 3종의 후보인자의 간성상세포 활성도 감소 효과 확인. 후보인자의 간성상세포 활성도 감소 효과를 확인하기 위하여 초대배양 간성상세포에 각각의 후보인자를 처리하여 세포의 모양을 phase-contrast 현미경을 이용하여 관찰함 (A). 또한 α-SMA의 발현량을 면역형광염색 (B)과 western blot(C)을 통하여 분석함
표 3종 후보물질의 간성상세포 활성도 감소 효과 및 최적 조합 확인. 3종 후보물질의 간성상세포 활성도 감소 효과를 간성상세포주(hTert-HSC)에서 다시 한 번 면역형광염색 (A)과 western blot (B)을 통해 검증함. 3종 후보물질의 유효 조합을 확인하기 위해 간성상세포주에 3종의 후보물질을 각각 또는 모두 처리하여 western blot을 통해 α-SMA 발현을 확인함 (C)
표 MFG-E8의 농도별 간성상세포 활성도 감소 효과를 확인하기위해 초대배양 간성상세포 (A)와 hTert-HSC (B)에 MFG-E8을 농도별로 처리하고, α-SMA의 발현량을 western blot으로 확인함
표 MFG-E8의 농도별 조직재생 효과 확인. 간섬유화 재생에의 MFG-E8의 적정 농도를 확인하기 위해 만성 간섬유화 모델인 CCl4-induced 간섬유화 모델에서 조직재생 효과를 확인함. Sirius-red 염색을 통해 조직 내 축적된 collagen을 붉게 염색하고 (A), 염색된 영역을 imageJ를 이용하여 정량화함 (B). MFG-E8 low = 32μg(MFG-E8)/kg(mouse weight), medium = 160μg/kg, high = 320μg/kg
표 MFG-E8의 농도별 조직재생 효과 확인. 간섬유화 재생에의 MFG-E8의 적정 농도를 확인하기 위해 만성 간섬유화 모델인 TAA-induced 간섬유화 모델에서 조직재생 효과를 확인함. Sirius-red 염색을 통해 조직 내 축적된 collagen을 붉게 염색하고 (A), 염색된 영역을 imageJ를 이용하여 정량화함 (B). MFG-E8 low = 32μg(MFG-E8)/kg(mouse weight), medium = 160μg/kg, high = 320μg/kg
표 조직재생 후보물질의 세포 내 신호전달 기전 조사. 간섬유화 과정에서 MFG-E8과 섬유화 관련 단백질 간의 potential network interation을 나타낸 그림(실선=활성화, 점선=저해)
표 세크레톰의 조직재생 신호전달 기전 확인. (A) 간성상세포주에 중간엽줄기세포와 간세포로 교차분화시킨 중간엽줄기세포의 세크레톰(secretome)을 각각 처리하여 smad 신호전달기전에의 영향을 western blot으로 분석하였음. (B) 간성상세포주에 간세포로 교차분화시킨 중간엽줄기세포의 세크레톰을 농도별로 처리하여 smad 신호전달기전에의 영향을 western blot으로 분석하였음
표 초대배양 간성상세포에 MFG-E8을 농도별로 처리한 경우 smad 신호전달기전에의 영향을 western blot으로 분석하였음
표 MFG-E8의 세포와의 상호작용 기전 분석. MFG-E8과 integrin αvβ3의 결합을 저해하는 anti-integrin αvβ3 항체를 10μg/ml로 처리하여 MFG-E8의 간성상세포 활성도 감소에 관여할 것으로 보이는 하위 신호전달기전 단백질의 발현량을 western blot(A)과 real-time PCR(B)로 확인하였음
표 MFG-E8의 간성상세포와의 상호작용을 통한 간섬유화 재생기전 모식도

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