[보고서]미세조류의 지방생산 유전자 개발

이영숙

보고서 정보

주관연구기관

포항공과대학교
Pohang University of Science and Technology

연구책임자

이영숙

참여연구자

전소영 , 곽남희 , 황재웅

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-08

과제시작연도

2019

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202000001222

과제고유번호

1711082302

사업명

글로벌프론티어지원(R&D)

DB 구축일자

2020-05-30

키워드

클라미도모나스.바이오에너지.지방 대사.소포체 스트레스.트라이아실 글리세롤.Chlamydomonas.Bioenergy.Lipid metabolism.ER stress.Triacyl glycerol (TAG).

표 각 균주별 배양 조건에 따른 지질 염색 dye의 형광 세기 정도의 변화. sta6는 일반 조건 (A)에 비해 지질 합성을 유도하는 질소 결핍 조건 (B)에서 지방체에 대한 Nile red 형광 세기가 7배 이상 증가하였다
표 Chlamydomonas reinhardtii 균주들의 생장곡선. Chlamydomonas center로부터 분양받은 여러 종류의 Chlamydomonas 균주들의 생장을 알아보기 위해 고체 TAP 배지에 키워 각 시간별로 세포수를 세어 균주들 간에 생장을 분석했다
표 질소 결핍에 의한 Chlamydomonas의 지방체 형성 관찰. Chlamydomonas CC-2290 세포들을 질소가 첨가된 TAP 배지 (N+)와 질소가 결핍된 TAP 배지 (N-)에서 3일 동안 배양한 후 Nile red 와 BODIPY형광 시약으로 염색하여 형광현미경하에서 지방체를 관찰함. 질소결핍 조건에 의해 Nile red와 BODIPY의 형광이 증가됨을 확인
표 BODIPY와 Nile red의 형광 세기 비교. (A) BODIPY는 지질이 없는 조건에서도 매우 강한 형광 세기를 보이기 때문에 외부의 BODIPY에 대한 형광을 제거하는 방법이 필요하다. (B) Nile red는 지질이 없는 조건에서는 blank (증류수) 조건과 비슷한 형광값을 보인다
표 (A) Chlamydomonas에서 지질을 추출한 후 중성지방과 인지질을 분리하는 방법을 성공적으로 구축하였다. (B) 추출한 지질을 GC-MS를 이용하여 정성적 및 정량적 분석이 가능하다
표 삽입 돌연변이체를 이용한 지질합성 관련 돌연변이 선별. (A) CC-125 균주의 nucleus genome에 Hygromycin B 저항성 유전자인 APH7을 삽입하여 돌연변이체를 제작한다. (B) High-throughput screening을 실시한다. 중성지방을 염색하는 Nile red로 각각의 mutant를 염색한 후 형광세기를 multiplate reader로 비교하여 그 세기가 강한 돌연변이체를 선발한다. (C) Multiplate reader 뿐만 아니라 형광현미경을 통해 증가된 오일바디를 관찰한 후 1차 screening에서 선별된 돌연변이체를 2차, 3차 screening을 통해 재확인한다. (D) 3차 screening으로 부터 선별된 돌연변이체에서 지질을 추출한 후 thin layer chromatography (TLC), gas chromatography를 이용하여 정량적 및 정성적 분석을 통해 최종 돌연변이체를 선반한다
표 (A) 96-well plate와 48-well plate를 이용한 1차, 2차, 3차 screening 과정으로 3일 동안 배양한다. (B) 서로 다른 세 가지 조건(TAP(+N), TAP(-N), TAP(-N, -Acetate))에서 배양된 돌연변이체를 Nile red로 염색한 후 형광세기를 비교하여 중성 지방 함량이 변한 돌연변이체를 선별한다
표 Chlamydomonas chemical screening 개요
표 Chemical screening 선별 과정. 각 well에서의 cell density 및 Nile red 형광 값을 음성 대조군을 1로 하여 그 상댓값을 도출하였다. FI/FIDMSO가 1.4 이상인 화합물질들을 선별하였다. 현재 10,000개의 chemical library중에서 6,480개의 library에 대해서 선별을 완료하였으며, 9개의 후보군을 선별하였다
표 Chemical screening을 통해 선별한 9개의 후보군들. 9개의 화합물질 중 1 개를 제외하고는 생장이 음성 대조군의 80% 수준으로 큰 영향을 받지 않았다. 한편 Nile red의 형광세기는 음성 대조군에 비해서 40% 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다
표 BFA의 지질 생성 효과 확인. (A) 현미경 관찰을 통해 BFA를 처리한 cell이 음성대조군에 비해 지방체에 대한 형광 값이 증가한 것을 확인하였다. (B) Flow cytometry를 통해 BFA를 처리한 cell이 음성 대조군에 비해 Nile red 형광 세기가 큰 cell들의 수가 증가한 것을 확인하였다. (C) BFA를 처리하였을 때 음성 대조군에 비해 TAG의 축적량이 33% 증가 하였다. (D, E) BFA에 대한 지질 증가는 탄소 및 질소 결핍 조건과는 독립적으로 일어난다. (F, G) Chlorella에 BFA를 처리하였을 때에도 지방체에 대한 Nile red 형광 세기가 증가한 것을 확인하였다
표 BFA 처리에 따른 TAG를 구성하는 fatty acid 조성과 membrane lipid 변화 분석
표 Fenpropimorph를 처리하여 변화한 Chlamydomonas의 TAG, phospholipids
표 시간별 fenpropimorph 처리에 의한 Chlamydomonas의 TAG 축적 양상
표 종자의 저장 지방 합성에 관여하는 ABCA9의 기능 연구. (A) ABCA9을 과발현한 mutant는 야생종에 비해 큰 종자를 생성했다. (B) ABCA9을 과발현한 mutant 종자에서 야생종에 비해 종자의 TAG 함량 증가함. (C) ABCA9을 과발현한 mutant 종자의 배아 세포는 야생형보다 증가함. (D) 야생종과 mutant의 배아를 분리하여 14C-acetate, 14C-oleyol-CoA, 14C-Oleic acid가 포함된 buffer에서 uptake assay 수행하여 TAG를 추출해 DPM 값을 측정한 결과, mutant의 경우 14C로 label된 fatty acid를 TAG 합성 장소인 ER로 수송하는 능력이 상실되어 야생종에 비해 TAG 합성이 적게 된 것으로 생각한다
표 ABCG26의 knockout 돌연변이체는 종자를 거의 맺지 못하였는데 (A, abcg26-1과 abcg26-2), 꼬투리의 발달 자체에 문제가 있었다 (B, abcg26-1과 abcg26-2). 꽃을 관찰한 결과, 돌연변이체가 성숙한 꽃가루를 만들지 못하는 것이 원인임을 발견하였고 (C, abcg26), ABCG26이 꽃가루 벽 형성 시기에 매우 특이적으로 융단층에서 발현한다는 것을 알아내었다 (D, blue signal). 과연 돌연변이체는 꽃가루 벽을 제대로 형성하지 못하였고 (E, abcg26), 반대로 꽃가루 벽 지질의 전구체를 만들어 내보내는 융단층 안에는 밖으로 나가지 못한 전구체로 보이는 물질들이 돌연변이체에 축적되어 있었다 (F, abcg26)
표 꽃가루 코트 지질 형성에 관여하는 ABCG9과 ABCG31의 기능 연구. Anther에서 강하게 발현하면서, 서로 발현양상이 유사한 ABCG9와 ABCG31 (A, blue signal)을 분리하였고, double knnockout 돌연변이체 abcg9 abcg31을 제작하였다. abcg9 abcg31 식물은 정상적인 조건에서 꽃가루의 활성이 야생종이나 single knockout 돌연변이체에 비해 절반 정도로 떨어져 있었고 (B, abcg9 abcg31-1, abcg9 abcg31-2), 이는 습도가 높은 조건에서 다시 회복되었다 (C, abcg9 abcg31-1). abcg9 abcg31 꽃가루는 건조한 조건에서 쉽게 찌그러지거나 서로 뭉쳐져 존재하는 모습을 보였고 (D), 이런 결과가 환경적인 스트레스에 꽃가루가 잘 견디지 못한 때문이라 생각하여, 또 다른 환경 스트레스인 저온 조건에서 종자의 생산성을 비교한 결과, abcg9 abcg31 식물은 야생종이나 single knockout 돌연변이체들에 비해 종자를 거의 맺지 못하였다 (E, cold, abcg9 abcg31-1). abcg9 abcg31 꽃가루는 코트 발달이 미성숙한 표현형을 보였는데 (F, abcg9 abcg31-1), 꽃가루의 지질 분석 결과, streyl glycoside 함량이 감소해있었고 (G, abcg9 abcg31-1), steryl glycoside를 합성하지 못하는 돌연변이체도 abcg9 abcg31처럼 꽃가루의 활성이 감소하고 (H, pollen viability, ugt80A2 ugt80B1)건조 조건에서 쉽게 꽃가루가 찌그러지는 것을 관찰하였다 (H, EM picture, ugt80A2 ugt80B1)
표 Chlamydomonas의 ABCA2의 분자 생화학적 분석 결과. (A) ABCA2의 세포 내 위치 분석. (B) 야생종과 ABCA2 과발현체의 TAG 함량 분석
표 야생종 (WT) 과 돌연변이 (E3L) 의 nile red assay. 질소 결핍 조건 3일 처리한 야생종 (WT)과 돌연변이 (E3L) 의 nile red 형광 값을 흡광도(OD)로 비교 정량 했을 때 돌연변이체에서 약 50% 감소하였다
표 야생종 (WT)과 E3L에서 흡광도와 세포 수의 관계 비교
표 E3L에서 insertion site 탐색 및 유전자 발현 확인
표 투과 전자현미경 (Transmission Electron Microscopy) 를 이용한 야생종 (WT) 과 E3L의 내부구조 관찰
표 야생종 (WT) 과 E3L의 starch 양 비교
표 애기장대, 벼, Chlamydomonas의 Maltose Transporter (MEX)의 아미노산 서열 비교
표 Mutant 1-12의 TAG 표현형 분석
표 mutant 1-12 genome 상의 AphVII 삽입위치 동정
표 mutant 1-12의 지질분석
표 돌연변이 1-12의 E.coli complementation 실험
표 Mutant 1-12에 축적되는 TAG의 양과 엽록체 막 지질인 MGDG와 DGDG의 지방산 조성 분석
표 CrLPAAT1의 세포내 위치 분석 실험
표 소포체 스트레스 조건에서 Chlamydomonas의 반응
표 Yeast 돌연변이체 Δire1 mutant를 이용한 Chlamydomonas IRE1 (CrIRE1)의 complementation test. (A) 실험에서 사용한 다양한 IRE1 단백질 구조. (B-C) 다양한 형태의 IRE1으로 형질전환된 Δire1 yeast strain KMY1515 의 성장 비교 (D) IRE1으로 형질전환된 효모에서 측정한 소포체 스트레스의 세기 비교
표 새로운 Chlamydomonas 돌연변이체 ire1-1 , ire1-2 순수분리. (A) Chlamydomonas 돌연변이체 ire1-1 , ire1-2 의 insertion cassette 위치. (B) ire1-1 , ire1-2 돌연변이체의 genotyping 결과. (C) 소포체 스트레스 조건에서 ire1-1 , ire1-2 돌연변이체의 CrIRE1 발현양상
표 ire1 돌연변이체의 소포체 스트레스 반응성 및 표현형 관찰 (A) Tunicamycin 처리 조건에서 ire1 돌연변이체의 chlorosis (B) Tunicamycin 처리 조건에서 ire1 돌연변이체 cytolysis 현상 관찰. Red arrow heads, cytolysis of ire1 mutant cells. (C) Tunicamycin 처리 조건에서 배양액 내 Chlamydomonas의 총 세포수 (위), 관찰된 세포수 (아래) (D) Tunicamycin 처리 조건에서 Chlamydomonas의 엽록소 양 비교 (E) Tunicamycin 처리 조건에서 발생한 lipid droplet 비교 (F) Tunicamycin 처리 조건에서 축적된 TAG 정량 비교
표 crire1 돌연변이체의 tunicamycin(Tm) 민감성 표현형에 대한 유전학적 분석 (A) Tetrad 분석방법을 이용한 표현형과 유전자형의 상관성 증명 (B) 돌연변이체 ire1-1 , ire1-2 의 insertion cassette 위치. (C) 돌연변이체 ire1-1 , ire1-2 배수체(diploid) 의 유전자형 분석. (D) Spot assay를 이용한 돌연변이체 ire1-1 , ire1-2 배수체의 tunicamycin 민감성 조사
표 돌연변이체 ire1 의 소포체 민감성과 ROS의 관련성. (A) 야생종(CC-4533)과 돌연변이체 ire1 의 산화적 스트레스 반응 유전자의 발현 양상 (B) 야생종(CC-4533)과 돌연변이체 ire1 의GSH synthetase 유전자들의 발현 변화 (C) Tunicamycin 처리 조건에서 야생종(CC-4533)과 돌연변이체 ire1 의 총 GSH 정량 비교 (D) Tunicamycin 처리 조건에서 돌연변이체 ire1 에 GSH를 공급해줬을 때 회복능력 측정
표 소포체 스트레스 처리 조건에서 마커 유전자의 발현 패턴 변화
표 소포체 스트레스 센서 Chlamydomonas IRE1의 타겟 전사인자 bZIP1 동정 (A) Chlamydomonas bZIP 전사인자들의 phylogenetic tree 분석 (B) 소포체 스트레스 조건에서 소포체 스트레스 센서 IRE1에 의해 splicing 되는 bZIP1 전사인자 발견. Unspliced bZIP1, bZIP1u; spliced bZIP1, bZIP1s. (C) bZIP1u mRNA 와 bZIP1s mRNA 의 구조 (D) bZIP1u 와 bZIP1s 아미노산의 구조 (E) Anti-bZIP1 antibody를 이용한 western blot 의 결과 (F) Transient expression을 이용한 bZIP1u-sGFP 의 세포 소기관내 위치. Bars = 50μm (G) 효모 돌연변이체 hac1p을 이용한 Chlamydomonas bZIP1s 의 complementation test
표 Chlamydomonas bZIP1 돌연변이체의 소포체 스트레스 표현형 분석. (A) 소포체 스트레스 조건에서 야생종과 bzip1 돌연변이체, complementation line의 chlorosis 표현형 분석 (B) 야생종과 bzip1 돌연변이체, complementation line의 성장 및 tunicamycin 처리 조건에서의 세포 활성 분석
표 bzip1 돌연변이체의 소포체 스트레스 마커 유전자 분석 결과
표 Chlamydomonas의 bZIP1 전사인자는 소포체 스트레스 조건에서 DGTS의 합성을 조절한다 (A) bzip1 돌연변이체는 소포체 스트레스 조건에서 야생종과 달리 DGTS의 합성을 촉진시키지 못하였다. (B) DGTS합성 모식도 (C) 소포체 스트레스 조건에서 DGTS합성 효소 BTA1의 발현 분석 (D) bZIP 전사인자와 BTA1 promotor의 yeast one hybrid 실험 결과
표 bZIP1 전사인자는 소포체 스트레스 조건에서 pinolenic acid의 합성을 조절하였다. (A) 전체 지질과 DGTS에서 pinolenic acid의 함량 비교 분석 (B) Pinolenic acid 합성 경로 (C) 소포체 스트레스 조건에서 pinolenic acid 합성에 관여하는 유전자들의 발현 분석 (D) Yeast one hybrid 실험을 통한 CrDES promoter와 bZIP1 전사인자의 binding 분석 결과 (E) crdes 돌연변이체의 tunicamycin 민감성 테스트 결과
표 소포체 스트레스 조건에서 bzip1 돌연변이체의 DGTT1과 PDAT1 유전자 발현 분석 결과 (A) PDAT1과 DGTT1에 의해 매개되는 TAG 합성 메커니즘 (B) Tunicamycin 처리 조건에서 DGTT1과 PDAT1의 발현 분석 비교
표 crdes 돌연변이체 분리 및 분석 (A) crdes 돌연변이체의 유전자형 분석, (B) 글리세롤 지질(glycerolipids), 전체 지방산 (Total FAs), PE, DGTS의 총 량. crdes1-1 와 crdes1-2 돌연변이체에서 제거되거나 감소한 pinolenic acid (파란 화살표), coniferonic acid (녹색 화살표)를 표시하였고 증가한 alpha-linolenic acid (빨간 네모 상자)를 나타냄
표 crdes 돌연변이체는 소포체 스트레스 조건에서 감수성을 보임 야생종 (C-9,CC-4533), 돌연변이체 (crdes1-1, crdes1-2, crbzip1-1, crbzip1-2) 의 스팟 테스트
표 RNA sequencing을 통한 소포체 스트레스 조건에서의 막 지질 생합성 경로 규명
표 BLZ8 돌연변이체의 마커 유전자 삽입 위치 및 발현양 분석 (A) Chlamydomonas와 애기장대의 bZIP 전사인자를 이용한 phylogenetic 분석 (B) BLZ8 전사인자의 모식도 및 blz8 돌연변이체의 마커 유전자 삽입 위치 (C) blz8 돌연변이체의 BLZ8 발현 분석 결과
표 blz8 돌연변이체의 산화적 스트레스 표현형 분석 결과 (A) blz8 돌연변이체의 superoxide를 일으키는 화합물에 대한 내성 분석 (B) blz8 돌연변이체의 peroxy-radical을 일으키는 화합물에 대한 내성 분석
표 blz8-1 돌연변이체에 BLZ8 gDNA fragment를 이용한 complementation test
표 클라미도모나스 bZIP 전사인자 BLZ8의 전사체 분석 (A) 산화적 스트레스 조건에서 BLZ8 OX 균주의 전사체 분석 결과의 상관관계 행렬 (B) BLZ8의 하위 유전자로 예상되는 CCM 관련 유전자군
표 blz8 돌연변이체의 낮은 CO2 높은 pH 스트레스 조건에서 표현형 분석 결과 (A) 낮은 CO2 높은 pH 조건에서 blz8 돌연변이체의 성장 표현형 분석 (B) 낮은 CO2 높은 pH 조건에서 blz8 돌연변이체의 chlorophyll a+b 정량
표 낮은 CO2 조건에서 CCM 유전자의 발현량 분석
표 BLZ8 전사인자의 작용 기작
표 Chlamydomonas DTH1 단백질의 돌연변이체 선별 (A) Chlamydomonas의 DTH1 유전 정보와 각각의 돌연변이체의 마커 유전자 삽입 위치 (B) 3개의 crdth1 돌연변이체의 genotyping 결과
표 질소 결핍조건(N-)과 질소원을 재공급되는 regrowth 조건(N+)에서의 CrDTH1의 발현 패턴 분석
표 crdth1 돌연변이체의 TAG 함량 분석 (A) 야생종 (dw15)와 돌연변이체 dth1-1의 TAG 함량 분석 결과 (B) 야생종 (CC4533)와 돌연변이체 dth1-2, dth1-3의 TAG 함량 분석 결과
표 돌연변이체 crdth1의 lipid droplet 형광 관찰 (A) Regrowth 조건에서 야생종 (dw15)과 dth1-1 돌연변이체의 nile red로 염색한 형광 현미경 사진 (B) Regrowth 조건에서 야생종 (CC4533)과 dth1-2, 1-3 돌연변이체의 nile red로 염색한 형광 현미경 사진
표 Apolipoprotein-like protein과 구조적 유사성을 보이는 CrDTH1AP 펩타이드를 순수 분리함 (A) CrDTH1의 중간 지점에 Apolipoprotein-like protein domain과 구조적 유사성을 보이는 부분 표시 (B) MBP가 결합된 CrDTH1AP 펩타이드 제작 (C) Amylose resin을 이용한 CrDTH1AP 펩타이드를 순수분리하여 coomassie blue staining(좌) 과 western blotting(우) 수행한 결과
표 Lipid binding assay를 통해 recombinant CrDTH1AP이 Phosphatidylethanolamine(PE)과 특이적으로 결합하는 활성 관찰함
표 Chlamydomonas에서 지질 축적에 중요한 역할을 하는 전사인자 탐색
표 Chlamydomonas에서 지질 축적을 조절하는 전사인자 스크리닝
표 질소 결핍 조건과 소포체 스트레스 조건에서 발현이 상승하는 Chlamydomonas MYB1 전사인자 선정
표 다양한 스트레스 조건에서 myb1 돌연변이체의 반응와 지질 축적 감소 표현형 관찰. 야생종 (CC-4533) 과 myb1-1 돌연변이체에서 스트레스 조건 (질소 결핍조건, 인 결핍조건, 소포체 스트레스 조건) 에서 축적하는 전체 지방산과 TAG의 양을 측정함
표 myb1 돌연변이체 순수분리 (A) myb1 돌연변이체의 유전형 분석, (B) MYB1 단백질의 topology 분석 (C) 야생종 (CC-4533) 과 myb1 돌연변이체에서 측정한 질소결핍조건에서 MYB1 유전자의 발현량 변화
표 질소 결핍조건에서 지질 합성에 관여하는 MYB1 전사인자의 역할의 유전학적 검증
표 야생종 (CC-4533) 과 myb1 돌연변이체 간의 지방산 조성 비교. 야생종과 myb1 돌연변이는 질소 결핍조건에서 3일간 처리한 뒤 GC-FID를 이용하여 지질 분석을 진행하였음
표 야생종(CC-4533) 과 myb1 돌연변이체에서 엽록체 유래 지방산을 수송하는 FAT1 유전자의 발현 비교 (A) Chlamydomonas의 TAG 대사경로와 엽록체에서 합성된 지방산을 소포체로 수송하는데 FAT1 단백질의 대사경로 상의 위치 (B) 질소결핍조건에서 FAT1 유전자의 발현량 변화

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