초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구의 목적 및 내용은 유전자가위와 줄기세포 기술을 이용하여 난치성 신경질환, 안질환 및 근육질환에 대한 (1) in vivo (1,4세부) 및 in vitro 질병 모델 (2세부) 제작하고, (2) 구축된 질병모델을 이용하여 새로운 유전자치료법 (1,4세부) 및 세포치료법 (2세부)을 개발함을 목표로 한다. 본 과제에서는 특히 유전자 및 세포치료시 안전성을 확보하기 위해 (3) 사용할 유전자벡터제작 및 제작된 세포에서 off-target을 완전히 배제할 전략을 수립하여 (제3세부) 연구를 진행한다

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구의 목적 및 내용은 유전자가위와 줄기세포 기술을 이용하여 난치성 신경질환, 안질환 및 근육질환에 대한 (1) in vivo (1,4세부) 및 in vitro 질병 모델 (2세부) 제작하고, (2) 구축된 질병모델을 이용하여 새로운 유전자치료법 (1,4세부) 및 세포치료법 (2세부)을 개발함을 목표로 한다. 본 과제에서는 특히 유전자 및 세포치료시 안전성을 확보하기 위해 (3) 사용할 유전자벡터제작 및 제작된 세포에서 off-target을 완전히 배제할 전략을 수립하여 (제3세부) 연구를 진행한다.

□ 연구개발성과
1) Human gene을 포함한 donor DNA 제작
- Exon5에 위치한 R124X 돌연변이를 포함하는 donor DNA 합성을 완료
2) 동물 모델 세포주에서 donor DNA insertion 조건 확립
- mouse cell line (neuro2a)에 유전자가위와 donor DNA를 전달하여 donor가 세포 내 특정 위치로 integration 되는 것을 확인하였음
3) 동물 모델의 배아에 유전자 가위 전달 조건 확립
- 동물(쥐) 배아에 Cas9 mRNA, guide RNA, donor DNA를 다양한 조건으로 주사하여 최적의 조건을 발굴하였음
4) 발견된 Lin28a의 유전자 돌연변이 (Lin28(R192G))의 새로운 PD 유발 기전 규명
- 유전자 가위로 제조된 환자(LIN28 돌연변이) 유래 isogenic hiPSC를 중뇌 도파민신포로 분화하고, 세포병적현상을 비교 분석하여 중뇌 초기 발생장에가 파킨슨병 발병으로 이어진다는 새로운 파킨슨병 유발기전 및 개념을 정립함.
5) PD환자에 대한 유전자 편집 기능강화 줄기세포이식치료법 개발
- Nurr1+Foxa2가 도입된 M2(A2)-type astrocyte 세포보호 효과 최적화 연구 수행됨
- 신경보호기능 강화된(Nurr1+Foxa2) M2(A2)형 astrocyte (공)이식으로 뇌조직 환경 개선 효과를 보고 Nurr1+Foxa2를 효율적으로 발현시킬 수 있는 유전자 편집방법 개발을 위하여 Sgk1 관련 연구로 확장함
- Nurr1+Foxa2가 발현된 astrocyte에서 Sgk1 발현이 저하되는 것으로 관찰되었으며, 이러한 Sgk1은 NF-kB 등의 염증반응에 관여함을 밝힘
6) hESC/iPSC에 dCAS-gene editing을 이용한 선택적 유전자 발현 조절 시스템 구축
- 선택적 유전자 발현 억제 시스템: dCas9-KRAB 줄기세포 구축 완료
상기 시스템을 응용하여 관심 유전자 (Mettl3) 발현을 조절할 수 있는 줄기세포주를 작성
7) 유전자가위의 정확도를 분석하기위한 시스템을 구축하였음.
- 정확한 유전자 변이를 확인가능한 소프트웨어를 제작하였음.
- 본 유전자가위 분석 시스템을 활용하여 Cas9과 Cas12a(Cpf1)이 동시에 작동할 수 있는 새로운 유전자가위 시스템을 개발하고 이 기술의 안정성 여부를 검증하는 데 활용함
- 환자유래의 BRCA1 유전자 변이에 대한 기능 검증에 있어 유전자가위를 제작하여 변이의 기능성 여부를 판단하여 임상 컨설팅에 도움을 주는 기술을 개발하였음
8) 치매 환자의 혈액과 조직에서 Mest/Peg1의 각인 조절의 이상을 발견함.
- Mest/Peg1 유전자의 발현에 의해 Wnt 신호의 이상이 발생하고, 이는 신경세포로의 분화 억제 및 뇌신경의 퇴화로 이어짐을 확인함.
- Rapamycin inducible CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 벡터 시스템을 구축하고, Mest mRNA의 발현을 유도할 수 있음을 확인함.
- 다양한 방법의 유전자 편집 방법을 이용하여 Mest/Peg1 유전자의 각인(imprinting) 조절의 이상이 AD의 새로운 병인기전임을 규명함.
9) Prominin promoter-RGR construct 확보.
- GFAP-dCas9-KRAB 또는 GFAP-dCas9-VP16 벡터를 포함하는 렌티바이러스의 제작을 위한 construct를 확보하고, 실제로 dCas7-KRAB 시스템이 배아줄기세포에서 적용함을 보임.

□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과)
- 현재 특별한 치료법이 없는 난치성 유전병 분야에서 유전자가위 및 자가이식 줄기세포 등을 이용한 치료법 개발을 통해 난치병 환자의 질병 치료에 기여할 수 있을 것으로 생각됨.
- 본 연구를 통해 가장 효율적이고 안전한 생체 내 유전자 교정 방법을 발굴 및 검증함으로써 다른 질환의 유전자가위 치료법 개발로 연결될 것임.
- 본 연구를 통해 개발된 생체 내 유전자 교정 방법과, off target 분석을 통한 부작용 예측 플랫폼은 임상에서 적용이 가능한 수준으로 다른 질병에 적용 가능할 것임.
- 이 과정에서 개발된 원천 기술은 기술 이전(최소 2건 이상)으로 연결되어 큰 경제적 효과를 거둘 것으로 기대됨.

(출처 : 요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 가. 연구의 최종 목표 ... 6
• 나. 주요 연구 배경 ... 6
• 2. 연구수행내용 및 성과 ... 9
• 1) 동물 model의 orthologous gene의 양쪽을 target하는 guide RNA 선정 및 검증 ... 9
• 2) Human gene을 포함한 donor DNA 제작 ... 9
• 3) Guide RNA의 활성을 세포주 상에서 T7E1 분석법 및 대량분석법으로 검증 ... 10
• 4) 동물 모델 세포주에서 donor DNA insertion 조건 확립 ... 11
• 5) 동물 모델의 배아에 유전자 가위 전달 조건 확립 ... 11
• 6) 보다 우수한 유전자가위 선정을 위해, 인공지능을 이용한 유전자가위 효율 측정 ... 11
• 7) 유전자 가위 전달을 위한 viral delivery 확립 및 효율 측정 ... 12
• 8) LIN28 변이에 의한 파킨슨병 병변 진행에 관한 연구 ... 12
• 9) DNAJC6 변이에 의한 파킨슨병 병변 진행에 관한 연구 ... 13
• 10) 마이토 콘드리아 관련 유전자 변이에 따른 파킨슨병 발병기전 분석 ... 14
• 11) 성상교세포 공배양에 의한 파킨슨병 세포이식치료 향상 ... 15
• 12) SGK1 저해에 의한 중뇌 유래 성상교세포 및 도파민 신경세포의 성숙 및 생존 향상에 관한 연구 ... 17
• 13) 신경전구세포와의 공배양에 의한 사람 전분화능 줄기세포의 효율적인 신경분화 유도 ... 18
• 14) dCAS 시스템을 이용한, 사람 전분화능 줄기세포 내 선택적 유전자 발현 시스템 제작 ... 19
• 15) 사람 전분화능 줄기세포로부터 세로토닌 신경세포 및 후뇌 오르가노이드 분화 프로토콜 수립 ... 21
• 16) 신규 유전자가위 개발 및 이에 대한 off-target 분석 ... 21
• 17) in vivo off-target 분석 시스템 구축 (Xenopus laevis model) ... 23
• 18) dCas9-KRAB / VPR Knock-in construct 구축 (2세부 연계) ... 24
• 19) METTL3 / METTL14 target gRNA Knock-in donor 구축 ... 24
• 20) 유전자가위 off-target 분석 시스템 구축 및 이를 이용한 최적의 gRNA선별 ... 24
• 21) 정확도 높은 gRNA를 이용한 gRNA library 구축법 개발 ... 25
• 22) 유전자가위를 이용한 환자유래 BRCA1 변이 기능분석법 개발 ... 25
• 23) 각인 유전자인 MEST/Peg1과 치매와의 연관성 규명 ... 26
• 24) Wnt signaling의 새로운 매개체로서의 TFEB의 역할규명 및 target 유전자의 발굴 및역할 규명 ... 36
• 25) NSC을 in vivo에서 효율적으로 targeting 하기 위한 Lentiviral vector, AAV vector constructs의 확보 ... 37
• 26) Guide RNA의 induclble 발현을 위한 벡터제작 완료 ... 38
• 27) Prominin promoter-RGR construct 확보. ... 39
• 28) Adult mice에서 NSC을 분리하고 실험에 필요한 양의 확보를 위한 시스템 구축. ... 39
• 29) 연구개발성과 ... 40
• 3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 41
• 3-1. 목표 ... 41
• 3-2. 목표 달성여부 ... 42
• 3-3. 목표 미달성 시 원인(사유) 및 차후대책(후속연구의 필요성 등) ... 48
• 4. 연구개발성과의 활용 계획 등 ... 49
• 붙임. 참고문헌 ... 49
• 끝페이지 ... 51