초록 ▼

유도만능 줄기세포는 체세포에 Oct4, Klf4, Sox2, C-myc 과 같은 인자를 처리하여 전분화능을 갖는 줄기세포로 유도한 것으로, 이 분야에 대한 연구는 전세계적으로 지속적인 성장세를 보이고 있음. 최근에는 특정 질환이 있는 환자의 체세포에서 유도만능 줄기세포를 얻어 질환의 병인 규명에 사용하려는 시도가 지속되고 있으며, 특히 질환의 병인이 특정 유전자와 관련될 경우 이러한 연구가 보다 활발하게 이루어지고 있음.
강직성 척추염은 척추 및 골부착부 염증을 특징으로 하는 만성적인 염증 질환으로, HLA-B27 유전자가

유도만능 줄기세포는 체세포에 Oct4, Klf4, Sox2, C-myc 과 같은 인자를 처리하여 전분화능을 갖는 줄기세포로 유도한 것으로, 이 분야에 대한 연구는 전세계적으로 지속적인 성장세를 보이고 있음. 최근에는 특정 질환이 있는 환자의 체세포에서 유도만능 줄기세포를 얻어 질환의 병인 규명에 사용하려는 시도가 지속되고 있으며, 특히 질환의 병인이 특정 유전자와 관련될 경우 이러한 연구가 보다 활발하게 이루어지고 있음.
강직성 척추염은 척추 및 골부착부 염증을 특징으로 하는 만성적인 염증 질환으로, HLA-B27 유전자가 질환의 발생과 연관되어 있는 것으로 알려져 있으나, 병태생리에 대해서는 아직 명확히 알려져 있지 않음. 본 연구는 강직성 척추염 환자에서 얻은 체세포에서 유도만능 줄기세포를 제작하고, 강직성 척추염의 주된 병리 중 하나인 조골세포 분화 이상에 차이가 있는지 알아보고자 하였으며, 강직성 척추염 환자의 병인에 중요한 역할을 하는 HLA-B27 유전자를 제거한 후의 변화가 있는지 관찰하고자 하는 연구임.

강직성 척추염의 분류기준에 명확하게 부합하는 환자 세 명을 선별하여 환자의 혈액으로부터 말초혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 를 분리하였고, 환자의 HLA-B27 유전자 양성 여부를 DNA 검사법으로 확인하였음. 유도만능 줄기세포를 얻기 위해, 환자의 PBMCs 에 역분화에 필요한 인자를 발현하는 Sendai virus를 넣어주고, 원심분리를 통해 배양접시에 부착되는 세포를 얻었음. 이러한 부착세포를 재배양하여 다시 원심분리 후 배양접시에 부착되는 세포를 얻는 serial seeding 방법을 통해 유도만능 줄기세포를 얻었음. 유도만능 줄기세포의 전분화능을 확인하기 위해 줄기세포주를 SSEA4, Oct 3/4, TRA-1-60, Sox-2에 결합하는 항체로 염색하여 단백질이 발현됨을 확인하였고, mRNA를 분리하여 PCR 방법을 이용하여 OCT3/4, SOX2, NANOG, LIN28을 확인하였음.

안정적으로 유지되는 유도만능 줄기세포를 배아체로 유도하였고, 21일간 골분화 배지에서 배양하여 육안적으로 뭉쳐지는 습성의 조골세포 형태를 확인하였음. 또한 조골세포의 특성을 확인하기 위해 osteoimage, alizarin red 염색으로 확인하였고, mRNA 발현을 PCR 방법으로 확인함. HLA-B27 유전자를 정상인의 유도만능 줄기세포와 강직성 척추염 환자의 유도만능 줄기세포에서 분화된 조골세포의 차이를 확인하기 위해 gene expression analysis를 진행하였고, 세포 이동 및 세포 분화와 연관된 mRNA 의 발현이 증가함을 확인하였음.

강직성 척추염 환자의 유도만능 줄기세포에서 HLA-B27 유전자를 제거하기 위하여 CRISPR/Cas9 plasmid를 제작하여 세포 내로 주입하였고, HLA-B27 의 발현이 억제된 세포주를 확인함. 여기에서 하나의 콜로니를 분리하기 위해 배양을 지속하고 있으며, off-target analysis를 통하여 유전자 교정의 효과 및 안전성을 높이고자 하고 있음. HLA-B 유전자는 상대적으로 크기가 크고, single nucleotide polymorphism (SNP) 나 유전자 변형이 많아 최종 결과를 내기 전까지 반복 실험 및 분석을 시행하고 있는 상태임.

본 연구를 통하여 강직성 척추염 환자 유래 유도만능 줄기세포주를 확보하였으며, 이로부터 조골세포 분화방법을 확립하고, 조골세포의 형상을 분석하였으며, 건강인 유래 유도만능 줄기세포주에서 분화된 조골세포와의 차이를 확인함. 또한 유전자 교정을 시도하여 강직성 척추염에서 HLA-B27 의 역할에 대한 지속적인 연구가 가능할 것으로 생각됨.

( 출처 : Ⅰ. 연구결과 요약문 3p )

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 목차 ... 2
• Ⅰ. 연구결과 요약문 ... 3
• Ⅱ. 연구내용 및 결과 ... 4
• 1. 연구과제의 개요 ... 4
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 4
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 4
• 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 7
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 7
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 7
• Ⅲ. 연구성과 ... 8
• 끝페이지 ... 9