초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구진은 난치성 유전병을 유전적으로 인간화한 동물모델을 구축하고, 유전자 가위를 이용해 질병 유전자의 기능을 정상화할 수 있는 효율적인 생체내 유전자 수술 방법을 개발한 후, 이 방법을 위에서 구축한 동물모델에서 검증함으로써 질병 치료를 위한 생체 내 유전자 수술법의 근간을 정립하고자 다음의 연구개발 목표로 연구를 계획하였다.

1) 인간화 동물모델을 만들기 위한 유전자 가위의 선정 및 donor DNA 제작, 삽입 조건 확립
2) 동물 모델 제작 및 검증하고 해당 질병을 치료하기

□ 연구의 목적 및 내용
본 연구진은 난치성 유전병을 유전적으로 인간화한 동물모델을 구축하고, 유전자 가위를 이용해 질병 유전자의 기능을 정상화할 수 있는 효율적인 생체내 유전자 수술 방법을 개발한 후, 이 방법을 위에서 구축한 동물모델에서 검증함으로써 질병 치료를 위한 생체 내 유전자 수술법의 근간을 정립하고자 다음의 연구개발 목표로 연구를 계획하였다.

1) 인간화 동물모델을 만들기 위한 유전자 가위의 선정 및 donor DNA 제작, 삽입 조건 확립
2) 동물 모델 제작 및 검증하고 해당 질병을 치료하기 위한 유전자 가위 선정
3) 생체 내(in vivo) 실험을 위한 전달물질(AAV, nanoparticle) 제작 및 동물모델로의 정맥주사
4) 유전자 교정 이후 DNA, RNA, 단백질 수준에서의 질병모델의 교정 효율 확인, 기능적 개선 여부를 판정

□ 연구개발성과
1) 동물 model의 orthologous gene의 양쪽을 target하는 guide RNA 선정
- 레버 선천성 흑암시 (Leber's congenital amaurosis, LCA)에 대해 동물 모델에서 대상으로 하는 RPE65 유전자를 타겟하는 효율이 높은 4가지 sgRNA 후보를 선정함
2) Human gene을 포함한 donor DNA 제작
- Exon5에 위치한 R124X 돌연변이를 포함하는 donor DNA 합성을 완료하였고 이를 embryo에 전달하려는 형태로 재료가 준비되었음
3) Guide RNA의 활성을 세포주 상에서 T7E1 분석법 및 대량분석법으로 검증
- T7E1 분석법을 수행하여 sgRNA의 효율을 비교, 검토 후 sgRNA4 선정함
4) 동물 모델 세포주에서 donor DNA insertion 조건 확립
- mouse cell line (neuro2a)에 유전자가위와 donor DNA를 전달하여 donor가 세포 내 특정 위치로 integration 되는 것을 확인하였음
5) 동물 모델의 배아에 유전자 가위 전달 조건 확립
- 동물(쥐) 배아에 Cas9 mRNA, guide RNA, donor DNA를 다양한 조건으로 주사하여 최적의 조건을 발굴하였음

□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과)
1) 본 연구에서 개발한 인간화된 동물 모델을 이용하여, 근육질환 및 안질환 환자에게 바로 임상적 적용이 가능한 유전자 가위 치료제를 개발할 수 있음
2) 현재 특별한 치료법이 없는 난치성 유전병 분야에서 유전자가위를 이용한 치료법 개발을 통해 근육질환 및 안질환 환자의 질병 치료에 기여할 수 있을 것으로 생각됨
3) 본 연구를 통해 가장 효율적이고 안전한 생체 내 유전자 교정 방법을 발굴 및 검증함으로써 다른 질환의 유전자가위 치료법 개발로 연결될 것임
4) 이 과정에서 개발된 원천 기술은 기술 이전으로 연결되어 큰 경제적 효과를 거둘 것으로 기대됨

(출처 : 요약문 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 연구수행내용 및 성과 ... 7
• 1) 동물 model의 orthologous gene의 양쪽을 target하는 guide RNA 선정 및 검증 ... 7
• 2) Human gene을 포함한 donor DNA 제작 ... 7
• 3) Guide RNA의 활성을 세포주 상에서 T7E1 분석법 및 대량분석법으로 검증 ... 8
• 4) 동물 모델 세포주에서 donor DNA insertion 조건 확립 ... 9
• 5) 동물 모델의 배아에 유전자 가위 전달 조건 확립 ... 9
• 6) 보다 우수한 유전자가위 선정을 위해, 인공지능을 이용한 유전자가위 효율 측정 ... 10
• 7) 유전자 가위 전달을 위한 viral delivery 확립 및 효율 측정 ... 10
• 3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 11
• 3-1. 목표 ... 11
• 3-2. 목표 달성여부 ... 11
• 4. 연구개발성과의 활용 계획 등 ... 15
• 붙임. 참고문헌 ... 15
• 끝페이지 ... 15