[보고서]선도물질 최적화를 통한 다제내성 극복 저해제 개발 및 평가

강린우

[국가R&D연구보고서] 선도물질 최적화를 통한 다제내성 극복 저해제 개발 및 평가
Development and evaluation of novel inhibitors for overcoming multidrug resistance through optimization of lead compound 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	건국대학교 KonKuk University
연구책임자	강린우
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-02
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202000004491
과제고유번호	1711093040
사업명	바이오.의료기술개발(R&D)
DB 구축일자	2020-07-29
키워드	다제내성단백질.신규 저해제.선도물질.용해성.침투성.Multidrug resistance protein.New inhibitor.Lead compound.Solubility.Permeability.

초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
• 다제내성 제어를 위한 신규 항균소재 발굴을 위해서, 다제내성단백질의 구조 프로티오믹스 기술(carbapenemase의 총체적 및 원자수준에서의 작용기작)을 이용하여, carbapenemase에 대한 저해제 선별, 그들의 chemical 합성 및 구조 분석 그리고, 선별된 신규 저해제의 solubility 증진 및 세포내 침투 능력 분석을 그 목표로 함.
• Chemicals과 carbapenemases 사이의 affinity 분석을 통하여 저해제를 선별하였고, 선별된 신규 저해제의 chemical synthesis 및 구조 분석(LC/MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR)을 수행하였으며, 용해성이 낮은 저해제의 solubility 개선 방안 모색의 방안으로 chemical 재합성 및 용해성 분석을 수행하였음. 침투성이 향상된 신규 저해제를 선별하기 위해서, 다제내성균에 유효한 효과를 나타낸 신규 저해제의 세포내 침투 능력을 분석함.

□ 연구개발성과
• 3차 구조기반의 저해제 시스템의 결과로부터 도출된 화합물의 정보를 받아 6개의 타겟(GIM-1, IMP-1, NDM-1, VIM-2, CphA, GOB-18)에 모두 잘 결합할 것으로 예측되는 화합물(저해제; DRPL-1001, DRPL-1002, DRPL-1003, DRPL-1005, DRPL-1006, DRPL-1007, DRPL-1009, DRPL-1010)을 선별하여 합성 및 구조 분석(LC/MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR)을 진행하였음.
• SPR을 이용하여 carbapenemase와 10개의 저해제의 affinity를 측정하여 가장 affinity가 높은 물질(DRPL-1001, K_D = 1.97 x 10^-10)을 선별함.
• 용해도가 낮은 DRPL-1001에 OCL-4의 fragment를 첨가하여 용해도가 증가된 유도체[DRPL-1001-1(DRPL-1011로 명명)]를 합성하였음.
• 용해도 측정과 효능 평가 결과, PEG를 첨가한 9종의 유도체들의 용해도는 증가하였지만 저해 효능이 감소되었음. OCL-4의 fragment를 이용하여 합성된 유도체(DRPL-1011)의 경우 용해도와 저해 효능이 모두 증가된 결과를 확인 할 수 있었음.
• 세포내 침투 능력을 향상시키기 위해서 상기 유도체(DRPL-1011)에 대해서 ethylamine을 첨가한 시도에서, DRPL-1011로부터 유도된 2종(DRPL1013 및 DRPL-1015)이 합성되었으며 그들의 구조 분석(LC/MS, ¹H-NMR,¹³C-NMR)을 진행하였음.
• 세포내 침투 능력 분석 시스템을 구축하였고, ethylamine을 첨가한 2종의 유도체들(DRPL1013 및 DRPL-1015)이 세포내 침투 능력이 향상되었음 확인 함.

□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과)
• 향후 국가적 재난을 야기할 수 있는 다제내성균에 대한 대응책 확립
• 선진국의 항균제내성 극복화 전략의 초기단계를 따라 잡을 수 있음
• 본 저해제 개발은 항균제 발견 이전의 암흑시대로 전환되는 것을 방지할 수 있음
• 다제내성균에 대한 새로운 항균제 개발이 지체되고 있는 이유로, 신규 저해제는 그람음성 병원균 치료에 사용되는 항균제인 carbapenem의 유용성을 증대
• 저해 효능, 용해도, 침투 능력이 탁월한 “carbapenemase 저해제” 개발 연구로 실제적 기술이전 가능성이 높음

(출처 : 요약문 4p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
요약문 ... 4
목차 ... 5
1. 연구개발과제의 개요 ... 6
1.1. 연구개발의 목적 ... 6
1-2. 연구개발의 필요성 ... 6
2. 연구수행 내용 및 성과 ... 7
2-1. 연구수행 방법 ... 7
2-2. 연구수행 내용 ... 8
2-3. 연구 성과 ... 42
3. 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 ... 43
3-1. 목표 ... 43
3-2. 목표 달성여부 ... 43
3-3. 목표 미달성 시 원인(사유) 및 차후대책(후속연구의 필요성 등: 해당사항 없음. ... 43
4. 연구개발성과의 활용 계획 등 ... 43
붙임. 참고문헌 ... 45
끝페이지 ... 45

표/그림 (61)

표 Synthesis of compound 1 (DRPL-1001)
표 Compound 1 (DRPL-1001) of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. Mp 323 ℃ LC/MS: MH+192. 1H-NMR (DMSO):d 7.62 (d, 1H, 4-H), 7.76 (s, 2H, 2,6-H), 8.44 (br s, 2H, OH). 13C-NMR (DMSO): d 129.3 (4-C), 131.9 (2,6-C), 132.8 (1-C), 134.2 (3,5-C)
표 Synthesis of compound 2 (DRPL-1005)
표 Compound 2 (DRPL-1005) of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. Mp 102-107 ℃. LC/MS: MH+ 197. 1H-NMR (DMSO): δ 3.31 (s, 3H, OCH3), 3.68 (t, 2H, CH2), 4.18 (t, 2H, CH2), 6.91 (d, 1H, 4-H), 7.27 (t, 1H, 5-H), 7.40 (m, 2H, 2,6-H), 8.08 (br s, 2H, OH). 13C-NMR (DMSO): δ 58.9 (OCH3), 67.1 (CH2), 71.0 (CH2), 116.8 (4-C), 120.1 (6-C), 127.0 (2-C), 129.0 (5-C), 136.2 (1-C), 158.3 (3-C)
표 Synthesis of compound 3 (DRPL-1006)
표 Compound 3 (DRPL-1006) of (A) 1H-NMR and (B) 13C-NMR spectra. Mp 209 ℃. LC/MS: MH+ 177. 1H-NMR (DMSO): δ 7.70 (m, 2H, 2,6-H), 8.44 (br s, 2H, OH). 13C-NMR (DMSO): δ 117 (2,6-C), 136.5 (1-C), 138.5 & 142.5 (4-C), 149 & 152 (3,5-C)
표 Synthesis of compound 4 (DRPL-1007)
표 Compound 4 (DRPL-1007) of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. Mp 289-302 ℃. LC/MS: MH+202. 1H-NMR (D2O):d 7.62 (m, 4H). 13C-NMR (DMSO):d 124.0 (4-C), 130.9 (3,5-C), 136.1 (2,6-C), 137.8 (1-C)
표 Synthesis of compound 5 (DRPL-1008)
표 Compound 5 (DRPL-1008) of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. Mp 228-229 ℃. LC/MS: MH+167. 1H-NMR (DMSO):d 7.40 (t, 1H, 5-H), 7.84 (s, 2H, OH), 8.00 (m, 2H, 4,6-H), 8.42 (s, 1H, 2-H), 12.53 (s, 1H, COOH). 13C-NMR (DMSO):d 128.1 (5-C), 130.3 (3-C), 131.4 (6-C), 135.1 (1-C), 135.7 (4-C), 138.9 (2-C), 168.2 (COOH)
표 Synthesis of compound 6 (DRPL-1009)
표 Compound 6 (DRPL-1009) of 1H-NMR spectra and 13C-NMR spectra. Mp 210-217 ℃. LC/MS: MH+164. 1H-NMR (DMSO):d 2.63 (s, 3H,CH3), 7.50 (t,1H,5-H), 8.05 (m,2H,4,6-H), 8.27 (s,2H,OH), 8.44 (s,1H,2-H). 13C-NMR (DMSO):d 27.2 (CH3, 128.3(5-C), 130.1(6-C), 134.5(4-C), 135.1(1-C), 135.5 (3-C), 138.3(2-C), 198.7(CO)
표 Synthesis of compound 7 (DRPL-1010)
표 Compound 7 (DRPL-1010) of 1H-NMR spectra. Mp 284-285 ℃. LC/MS: MH+167. 1H-NMR (DMSO-d6 + 1% H2O): δ 7.65 (1H, t), 8.17 (1H, d), 8.24 (1H, d), 8.6 (3H, s)
표 The measurement of the dissociation constant between chemicals (DRPL-1001 ∼ DRPL-1010) and NDM-1 using surface plasmon resonance in HEPES buffer (pH 6.8). NDM-1: 1945 RU, chemicals: 500 uM
표 The measurement of the dissociation constant between chemicals (DRPL-1001 ∼ DRPL-1010) and NDM-1 using surface plasmon resonance in PBS buffer (pH 6.8). NDM-1: 1945 RU, chemicals: 500 uM
표 Comparison of KD values of NDM-1 and inhibitors (DRPL-1001 ∼ DRPL-1010) in HEPES buffer conditions (pH 6.8)
표 Comparison of KD values of NDM-1 and inhibitors (DRPL-1001 ∼ DRPL-1010) in PBS buffer conditions (pH 6.8)
표 Result of the combined effect of β-lactams (imipenem) and OCL-4 against a multiple-drug resistant stain and two transformants producing class B carbapenemase
표 Synthesis of DRPL-1001-PEG-1
표 DRPL-1001-PEG-1 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+248.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 3.85 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 4.03 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 7.45 (brs, 2H). 13C-NMR (300MHz, CD3OD):δ = 60.89, 74.24, 127.79, 133.45
표 Synthesis of DRPL-1001-PEG-2
표 DRPL-1001-PEG-2 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+293.3. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 3.65-3.73 (m, 4H), 3.90 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 7.58 (brs, 2H). 13C-NMR(300MHz, CD3OD):δ = 60.87, 69.88, 72.34, 72.41, 128.17, 133.80
표 Synthesis of DRPL-1001-PEG-3
표 DRPL-1001-PEG-3 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+355.9.1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 3.58 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.65-3.70 (m, 4H), 3.73-3.76 (m, 2H), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 7.64 (brs, 2H). 13C-NMR(300MHz, CD3OD):δ = 60.84, 70.00, 70.04, 70.33, 72.31, 72.36, 128.31, 133.88
표 Synthesis of DRPL-1001-PEG-4
표 DRPL-1001-PEG-4 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+355.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 3.55-3.59 (m, 2H), 3.62-3.69 (m, 8H), 3.71-3.74 (m, 2H), 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 7.67 (brs, 2H). 13C-NMR(300MHz, CD3OD):δ = 60.85, 69.99, 70.19, 70.26, 72.26, 72.45, 128.39, 133.99, 152.37
표 Synthesis of DRPL-1001-PEG-5
표 DRPL-1001-PEG-5 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+ 424.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 3.56 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.62-3.69 (m, 12H), 3.70-3.74 (m, 2H), 3.88 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 7.68 (brs, 2H). 13CNMR(400MHz ,CD3OD):δ = 60.87, 70.01, 70.17, 70.21, 70.36, 72.28, 72.50, 128.48, 131.75, 134.05, 152.61
표 Synthesis of DRPL-1010-PEG-1
표 DRPL-1010-PEG-1 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+ 228.0. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.93 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.24 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 59.97, 70.85, 113.71, 130.28, 139.43, 139.84, 153.35
표 Synthesis of DRPL-1010-PEG-2
표 DRPL-1010-PEG-2 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. Mp 323 ℃. LC/MS: MH+ 271.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.66-3.69 (m, 4H), 3.90 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 60.90, 68.96, 69.20, 72.62, 113.73, 130.17, 139.35, 139.84, 153.20
표 Synthesis of DRPL-1010-PEG-3
표 DRPL-1010-PEG-3 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+ 316.1. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.58 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.64-3.67 (m, 4H), 3.73-3.75 (m, 2H), 3.90 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 60.86, 69.03, 69.15, 70.08, 70.62, 72.29, 113.73, 130.14, 139.32, 139.86, 153.06
표 Synthesis of DRPL-1010-PEG-4
표 DRPL-1010-PEG-4 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+358.0. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.54-3.56 (m, 2H), 3.61-3.67 (m, 8H), 3.71-3.75 (m, 2H), 3.89 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.92 (brs, 1H), 8.06-8.13 (m, 1H). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 60.84, 68.99, 69.18, 69.99, 70.20, 70.55, 72.25, 113.78, 130.15, 139.31, 139.88, 153.15
표 Synthesis of DRPL-1010-PEG-5
표 DRPL-1010-PEG-5 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+403.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.54-3.56 (m, 2H), 3.61-3.67 (m, 12H), 3.70-3.74 (m, 2H), 3.90 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.93 (brs, 1H), 8.08-8.13 (m, 1H). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 62.28, 70.44, 70.64, 71.42, 71.57, 71.59, 71.62, 72.02, 73.68, 115.26, 131.55, 140.72, 141.35, 154.60
표 Synthesis of DRPL-1001-1
표 DRPL-1001-1 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+329.9. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):δ = 6.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.06 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H). 13C-NMR (300 MHz, CD3OD):δ = 113.82, 116.75, 119.21, 124.09, 125.93, 128.62, 131.60, 132.08, 136.73, 151.10
표 Water solubility of derivatives for DRPL-1001 and DRPL-1010
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against K. pneumoniae M160237 clinical isolate producing NDM-1
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against A. baumannii ABA0305 clinical isolate producing IMP-1
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against P. aeruginosa PAE0832 producing VIM-2
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against C. freundii 11-7F4560 clinical isolate producing VIM-2
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against E. coli TOP10 producing CphA
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against E. coli TOP10 M160237 clinical isolate producing ImiH
표 Result of the combined effect of β-lactams (meropenem, imipenem, and ertapenem) and DRPL-1001 and 6 derivatives of DRPL-1001 against E. coli TOP10 producing GOB-1
표 Synthesis of DRPL-1013
표 DRPL-1013 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+362. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ=7.70 (s, 2H), 7.26-7.24 (d, J = 8.8Hz, 1H), 6.81-6.80 (t, J = 3.0Hz, 1H), 6.59-6.56 (m, J = 4.0Hz, 1H), 3.07-2.95 (m, 4H). 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ=157.28, 148.99, 137.23, 135.77, 132.04, 130.22, 128.51, 118.79, 116.49, 40.20, 32.62
표 Synthesis of DRPL-1015
표 DRPL-10015 of (A) 1H-NMR spectra and (B) 13C-NMR spectra. LC/MS: MH+378. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ=7.69 (s, 2H), 7.21-7.19 (d, J = 8.8Hz, 1H), 6.67-6.66 (d, J = 2.4Hz, 1H), 6.22-6.19 (m, J = 3.9Hz, 1H), 4.17-4.15 (t, J = 5Hz, 2H), 3.32-3.30 (t, J = 5.0Hz, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ=157.94, 155.92, 149.08, 135.84, 131.80, 130.22, 118.02, 109.60, 104.19, 67.22, 40.31
표 (A) Ciproflxacin (positive control) and (B) kanamycin (negative control), and (C) four novel inhibitors were used to analyze permeability of Gram-negative outer membrane (E. coli　clinical isolate harboring blaNDM-1)
표 Growth and CFU curves of E. coli clinical isolate harboring blaMDM-1
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for ciproflxacin (positive control)
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for kanamycin (negative control)
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for novel inhibitor (DRPL-1001)
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for novel inhibitor (DRPL-1011)
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for novel inhibitor (DRPL-1013)
표 Analysis of Gram-negative outer membrane (E. coli harboring blaNDM-1) permeability for novel inhibitor (DRPL-1015)

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[국가R&D연구보고서] 선도물질 최적화를 통한 다제내성 극복 저해제 개발 및 평가
Development and evaluation of novel inhibitors for overcoming multidrug resistance through optimization of lead compound 원문보기