초록 ▼

본 연구과제의 총괄 목표는 세포배양 방식을 이용한 인플루엔자 후보 백신 주 및 주요 역가측정을 위한 품질 검증용 항원/항체 표준품 개발 및 제작 플랫폼 구축으로서 해당 과제를 통해 백신 생산용 MDCK 세포주를 이용한 후보 백신 주 제작과 이의 특성 분석, 제작된 후보백신 주를 이용한 세포배양 유래 후보 표준품 항원 및 항체 시약 제작과 이의 특성 분석, NIBSC 표준품과 제작된 후보 표준품을 이용한 역가 비교 시험을 수행하였다.

세포배양 유래 후보 백신 주 제작을 위하여, 호주의 WHO CC인 VIDRL로부터 세포배

본 연구과제의 총괄 목표는 세포배양 방식을 이용한 인플루엔자 후보 백신 주 및 주요 역가측정을 위한 품질 검증용 항원/항체 표준품 개발 및 제작 플랫폼 구축으로서 해당 과제를 통해 백신 생산용 MDCK 세포주를 이용한 후보 백신 주 제작과 이의 특성 분석, 제작된 후보백신 주를 이용한 세포배양 유래 후보 표준품 항원 및 항체 시약 제작과 이의 특성 분석, NIBSC 표준품과 제작된 후보 표준품을 이용한 역가 비교 시험을 수행하였다.

세포배양 유래 후보 백신 주 제작을 위하여, 호주의 WHO CC인 VIDRL로부터 세포배양을 통해 분리된 wild type의 A/Texas/50/2012 (A/H3N2) 및 B/Brisbane/60/2008 (B/Victoria lineage)을 공급 받았고, 이를 당사의 인플루엔자 백신 생산 세포주 (MDCK 부유 세포주)에 수차례 계대함으로써 감염력이 높은 세포배양 유래 후보 백신 주를 확보할 수 있었다. 또한, PCR을 통해 표면항원인 HA 및 NA 모두 유전적 변이가 없는 것을 확인하였다.

SRID 항원 표준품은 NIBSC, TGA 등을 통해 동결건조 제형의 불활화 된 whole virus type 항원으로 제공되는데 본 연구과제에서도 동일한 type의 세포배양 유래 후보 항원 표준품을 제작하기 위하여 2종의 세포배양 유래 후보 백신 주를 5L 배양기에서 배양 및 수득, 정제하여 불활화 된 whole virus type의 항원 물질을 확보하고, physicochemical method를 이용한 HA value assigning method를 확립함으로써 항원 물질의 HA 함량을 측정하였다. 또한, 확보된 항원 물질을 이용한 최적의 동결건조 cycle 및 buffer 조성을 확인하였으며 9개월 차까지의 안정성 확인 시험을 통해 HA 함량이 안정적으로 유지되는 조건을 적용하여 최종적으로 세포 배양 유래 후보 항원 표준품을 제작하였다.

SRID 항체 표준품은 불활화 된 항원 물질에 bromelain enzyme을 처리하여 bromelain cleaved HA (BHA) 항원을 추출 및 정제한 후 양(sheep)에 접종하여 얻은 항혈청으로 제작된다. 이와 동일한 방법으로, 불활화 된 세포배양 유래 항원물질에 bromelain을 처리하여 BHA 항원을 확보하는 공정을 확립하였으며 Freund‘s adjuvant와 함께 양에 수차례 접종하여 고농도의 항혈청을 확보하고 4주 동안 HI titer 측정을 통한 안정성 확인 후, 최종적으로 세포배양 유래 후보 항체 표준품을 제작하였다.

마지막으로, NIBSC 표준품과 제작된 후보 표준품을 이용하여 SRID 시험법을 통해 각 strain 별 단가원액의 HA 함량을 측정함으로써 역가 비교 시험을 수행하였다. 전반적으로 유정란 유래 항원 표준품 대비 세포배양 유래 항원 표준품 사용 시, HA 함량이 높게 측정되는 경향을 확인할 수 있었다. 최근 WHO ERLs에서는 세포배양 유래 항원 물질의 경우, physicochemical method 대신 LC-MS/MS 방법을 적용한 isotope dilution mass spectrometry (IDMS) 방법을 사용하고 있는데 IDMS와 같은 다른 시험법으로도 HA 함량을 측정하여 비교해보면 더욱 의미 있는 결론을 얻을 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구과제를 통하여 인플루엔자 바이러스에 대한 후보 백신 주 및 항원/항체 표준품 제작과정을 확립함으로써 제작 플랫폼을 구축하였고, 이를 바탕으로 향후 인플루엔자 대유행 등 비상사태 시 인플루엔자 백신을 유연하고 신속하게 생산할 수 있을 뿐만 아니라 정확한 역가측정을 통한 고품질의 백신을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.

(출처 : 요약문 6p)

Abstract ▼

The overall goal of this project is to develop cell culture derived candidate vaccine viruses (ccCVVs) and SRID standard reagents (antigen and antiserum) and to construct a manufacturing platform. In this project, we conducted production of ccCVVs using MDCK suspension cell line for influenza vaccin

The overall goal of this project is to develop cell culture derived candidate vaccine viruses (ccCVVs) and SRID standard reagents (antigen and antiserum) and to construct a manufacturing platform. In this project, we conducted production of ccCVVs using MDCK suspension cell line for influenza vaccine production and characterization of them, production of cell derived candidate standard reagents using ccCVVs and characterization of them, and comparison study of HA content using NIBSC standard reagents and cell derived candidate standard reagents.

For production of ccCVVs, wild type A/Texas/50/2012 (A/H3N2) and B/Brisbane/60/2008 (B/Victoria lineage) viruses isolated in cells were supplied from VIDRL, an Australian WHO CC. The viruses were passaged several times in our MDCK suspension cell line for influenza vaccine production, and then we could obtain the ccCVVs with high infectivity. In addition, it was confirmed by PCR analysis that both the surface antigens HA and NA have no genetic mutation.

The SRID antigen standard reagents are provided as a form of freezed-dried whole inactivated virus antigen through NIBSC, TGA and so on. In this project, to manufacture the cell derived candidate antigen standard reagents of the same type, two kinds of ccCVVs were cultivated in 5L bioreactors and harvested and purified. The antigen materials of whole inactivated virus type obtained through such a process were Opinion of Principal Investigator measured for HA content using an established HA value assigning method (physicochemical method). Moreover, the optimal freeze-drying cycle and buffer composition using the obtained inactivated antigen materials were confirmed through the stability test for 9 months, and the conditions were applied to produce cell derived candidate antigen standard reagents.

The SRID antiserum standard reagents are produced using antiserum obtained by inoculating sheep with purified bromelain cleaved HA (BHA) antigen, which is prepared by treating bromelain enzyme to inactivated antigen materials. In the same manner, a process of obtaining cell derived BHA antigen was established by treating bromelain to cell derived inactivated antigen materials. To obtain high titer antisera, sheep was inoculated several times with the prepared BHA antigens formulating with Freund's adjuvant and then collected antisera were characterized. After confirming the stability test results for 4 weeks by measuring HI titer of high titer antisera, we manufactured candidate SRID antiserum standard reagents.

Finally, we conducted the comparison study by measuring the HA content of monovalent bulk of each strain through SRID assay using NIBSC standard reagents and cell derived candidate antigen and antiserum standard reagents. Overall, the HA content tended to be measured higher when using cell derived antigen standard reagents than when using egg derived antigen standard reagents. WHO ERLs recently use the isotope dilution mass spectrometry (IDMS) method, which applies the LC-MS/MS method, instead of the physicochemical method for measuring HA content of cell derived inactivated antigen materials. If HA contents are measured by other methods such as IDMS method, a more meaningful conclusion can be obtained by comparing results
.
Through this project, we constructed a manufacturing platform by establishing processes for producing ccCVVs and cell derived SRID antigen/antiserum standard reagents. Therefore, it is expected that influenza vaccines can be produced flexibly and quickly in emergency situation such as a pandemic, and high quality influenza vaccines can be obtained through accurate measurements of HA potency.

(출처 : Summary 9p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 6
• 국문 요약문 ... 6
• Summary ... 9
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 12
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 12
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 26
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 39
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 115
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 116
• 제6장 총괄참고문헌 ... 117
• 제7장 총괄첨부서류 ... 119
• 끝페이지 ... 120