초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
□ 세부과제명: 전염성 코라이자 변이주 특성조사 및 유전자 진단법 개선 전염성 코라이자 변이주에 대한 특성 조사
O 원인균 수집 및 생물학적 특성 조사
- 2011년 이후 닭에서 전염성코라이자 26주 분리 및 동정
- 분리주는 모두 Gram(-), Catalase(-)으로, 성장배양조건(NAD 의존성등)에서 3가지 유형으로 분류 되었으며, 균주의 88.5%(23주/26주)가 NAD 의존형 코라이자균으로 확인되었고, NAD의존형 균주 중 1주에서 보통(Serum: 1%, NAD: 0.00

5. 최종 연구결과 요약
□ 세부과제명: 전염성 코라이자 변이주 특성조사 및 유전자 진단법 개선 전염성 코라이자 변이주에 대한 특성 조사
O 원인균 수집 및 생물학적 특성 조사
- 2011년 이후 닭에서 전염성코라이자 26주 분리 및 동정
- 분리주는 모두 Gram(-), Catalase(-)으로, 성장배양조건(NAD 의존성등)에서 3가지 유형으로 분류 되었으며, 균주의 88.5%(23주/26주)가 NAD 의존형 코라이자균으로 확인되었고, NAD의존형 균주 중 1주에서 보통(Serum: 1%, NAD: 0.0025%) 보다 높은 영양요구조건을 필요로 함.
- 국내 분리주에 대한 carbohydrate fermantation 반응조사 결과 NAD의존성 변이주에서는 Maltose와 Xylose에서 일반적인 NAD를 요구하는 균주와 차이를 보임.
- 혈청형 동정: 22주에서 A형으로 확인되었고 변이주 4주는 미동정 됨.
o 분리균주의 유전적 특성 조사
- 국내 분리주에 대한 16S rRNA와 Hemaglutinin antigen (HagA) gene의 phylogenetic analysis 실시(n=26)한 결과, 전형적인 코라이자균주는 하나의 cluster를 형성한 반면, 비 전형적인 4종의 균주는 전형적 균주와는 다른 cluster를 형성하였음.
- 16S rRNA분석결과 변이주 공통의 deletion 부위를 확인하였으며, 전형적인 균주와 변이주는 16S rRNA와 HagA 유전자에서 각각 97.3-98.2%와 95.2-97.2%의 상동성을 보임.
- 표준주와 국내 분리주 사이의 유전자적 상관성 평가를 위해 국내분리주(n=24) 대상으로 ERIC-PCR 실시한 결과, 전형적인 분리주는 두가지 유형으로, 차이가 크지 않는 반면, 변이주에서는 전형적인 국내분리주와 달랐고, 각각의 다른 유형을 보임.
- 전염성코라이자의 병원성과 관련된 cytolethal distending toxin(CDT) gene에 대한 유전자 분석 결과(n=6) 국내분리주 모두에서 CDT 유전자를 확인. 전체적인 유전적 상동성은 98%이상이었으며, 주된 변이가 보이는 cdtC부위는 96%이상으로 나타남
o 전염성코라이자균의 NAD의존성 여부에 따른 병원성 조사
- SPF닭에서 국내분리주(n=5)의 병원성을 NAD의존성 차이와 연관하여 평가하였음. 전염성 코라이자균주를 안와하동으로 접종하여 실험기간(7일)간 임상증상을 관찰한 결과 국내 변이 주는 전형적인 코라이자 균주(Yesan) 보다 낮은 임상증상과 균 분리율을 보임
o 바이오필름 형성능력 조사
- 바이오필름 형성능력 비교결과, 일반균주와 다르게 변이주 4주(n=4)에서는 바이오필름형성이 거의 확인되지 않음
° 전염성코라이자 국내분리주의 항생제 내성 결과
- 전염성코라이자 분리주(n=26)의 항생제 내성을 조사한 결과, amoxicillin-clavulanic acid, ceftiofur, gentamicin, spectinomycin에 높은 감수성(95% 이상)를 보임.
- 변이주에서 전형적인 코라이자 분리주보다 높은 항생제 내성을 보였으며 사용된 16종의 항생제 중, 6가지 이상의 항생제에서 내성을 가지는 것으로 확인됨

O 전염성 코라이자균 유전자 진단법 개선
o 균종 특이 유전자 조사 및 선발
- 국내분리한 전염성코라이자균의 유전적·생화학적 특성분석결과를 바탕으로, 전형적인 코라이자균 1주(Yesan)과 변이주 4주(14PC, l4Woori, 15AQ160, 15YH)에 대한 전장유전 체 및 비교유전체분석을 실시하고 특이 유전자를 조사함
- 전염성코라이자 공통유전자를 검색하여, HPG와 CDT부위에 대한 공통성 확인
o 국내 발생 전염성코라이자 균주 특성에 맞는 유전자 진단법 개발
- 기 발표된 realtime PCR법은 국내 변이주에 대해 낮은 민감도를 보임
- 기존의 HPG 및 CDT gene에 대한 표준주 및 국내분리주의 염기서열을 분석 및 프라이머 선발
- 감별진단이 필요한 Orthobacterium rhinotracheale (ORT)균과의 multiplex PCR 진단법 개발을 위해, 20이년 이후 분리한 ORT균 16주를 수집 및 기존에 발표된 ORT PCR법이 일부 국내분리주의 진단에 한계가 있음을 확인
• 기존 진단부위인 16SrRNA gene의 염기서열 분석 결과, 국내 분리주에 적합한 ORT 프라이머 및 조건의 재 설정 필요성 확인
- 전염성코라이자, ORT 동시감별이 가능한 conventional PCR, realtime-PCR 개발
• 전염성 코라이자 /ORT균 프라이머 선발 및 동시 진단조건 확립
• 민감도 및 특이도 조사 : 전염성코라이자 및 ORT 등 표준주 및 야외분리주 적용
• 기존 진단법과 비교하여 변이주를 포함한 국내 전염성코라이자 분리주 및 ORT 균에 대한 개선된 진단법 개발

(출처 : 요약 1p)

Abstract ▼

Title (1st subtitle) : Genotypic divergence of Avibacterium paragallinamm isolates with different growth requirements for nicotinamide adenine dinucleotide
In 2017, for the first time in Asia, we reported the isolation of variants of Avibacterium paragallinarum with atypical NAD dependency. The p

Title (1st subtitle) : Genotypic divergence of Avibacterium paragallinamm isolates with different growth requirements for nicotinamide adenine dinucleotide
In 2017, for the first time in Asia, we reported the isolation of variants of Avibacterium paragallinarum with atypical NAD dependency. The present study was conducted to characterize the genotypes of 24 isolates of Av. paragallinarum in Korea, including the four variants reported previously. Most of the typical isolates (19/20) showed a unique ERIC-PCR pattern with no ERIC-PCR patterns in common between the typical isolates and the variants. Furthermore, the variants shared no ERIC-PCR patterns among themselves. All the typical NAD-dependent isolates belonged to the same phylogenetic group based on both 16S rRNA and hagA gene sequences. The four variants were placed in several groups distinct from the typical isolates. In the 16S rRNA phylogenetic analysis, two of the variants were not closely aligned to any other Av. paragallinarum, isolate although they were clearly members of the genus Avibacterium. The other variants were clustered together with NAD atypical isolates from geographically diverse global locations. Compared with the Modesto reference strain AY498870, all the variants lacked a TTTTT stretch at positions 182-186 in the 16S rRNA gene and the same deletion was shown in most of the reported variants. The typical isolates and variants shared 97.3-98.2% and 95.2-97.2% nucleotide sequence similarity, for 16S rRNA and hagA, respectively. In addition, the similarities among variants were within 98.3-100% and 96.5-98.4% for the two genes, respectively. Our results indicate that the Av. paragallinarum variants with altered NAD growth requirements were genetically different and highly divergent from the typical NAD-dependent isolates
(출처 : Abstract 27p)


Title(2nd subtitle) : Pathogenecity of Avibacterium paragallinarum Isolates with different Nicotinamide Adenine Dinucleotide Requirements
paragallinarum (Av. paragallinarum). It causes economic losses from retarded growth in growing birds and reduction in egg production in layers. Normally, Av. paragallinarum requires nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) for growth. Among recent Korean field isolates of IC, four isolates were found to have different NAD requirements, three NAD-independent isolates and an isolates with increased NAD dependency. The present study was to determine the virulence of the Korean isolates that require more or no NAD for growth.
All birds inoculated with a typical field strain had distinct clinical signs and gross lesions and the isolation rate was higher than that of variant groups. Histopathologically, the epithelium of the infraorbital sinus in the group of a typical field strain had marked dissociation and necrotized epithelial cells with loss of cilia in the infraorbital sinus after 7 days post inoculation. Our results indicate that the Av. paragallinarum variants with altered NAD growth requirements shows lower pathogenicity than that of the typical strain. The factors affecting pathogenicity of Av. paragallinarum need to be determined.
(출처 : Abstract 28p)


Title(3rd subtitle) : Development of Improved Molecular methods for the Identification of Avibacterium paragallinarum and Ornithobacterium rhinotracheale
We reported the isolation of variants of Avibacterium paragallinarum with atypical NAD dependency in South Korea. These NAD-independent isolates could easily be misidentified as OrnUhobacterium rhinotracheale, another catalase negative, Gram negative organism. So diagnostic laboratories need to be alert to the possible presence of NAD-independent forms of Av. paragallinarum. Here, we developed a duplex polymerase chain reaction (PCR) assay to differentially identify Av. paragallinarum and Ornithobacterium rhinotracheale. The assay detected the reference strains and field isolates of Av. paragallinarum and Ornithobacterium rhunotracheale. No cross-reactions were observed with other Avibacterium species nor with bacteria and viruses likely to be present in swabs collected from suspected infectious coryza cases.
(출처 : Abstract 28p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 4
• 1. 재 료 ... 4
• 2. 연구전략 및 방법 ... 5
• III. 연구결과 ... 5
• 1. 제1세부과제명 : 전염성 코라이자 변이주 특성조사 및 유전자 진단법 개선 ... 5
• 2. 제2세부과제명 : 전염성코라이자균 유전자 진단법 개선 ... 12
• IV. 연구결과요약 ... 19
• V. 연구결과 고찰 ... 21
• VI. 참고자료 ... 22
• VII. 영문초록 ... 27
• 끝페이지 ... 28