보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
연구책임자 |
이지연
|
참여연구자 |
윤소윤
,
장일
,
김현아
,
배유찬
,
권용국
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2019-12 |
과제시작연도 |
2019 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO202000030791 |
과제고유번호 |
1545019642 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발(R&D) |
DB 구축일자 |
2020-11-21
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키워드 |
닭전염성기관지염.유전자 변이분석.대표균주.교차방어능.Infectious Bronchitis.Chicken.Infectiou Bronchitis Virus.
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초록
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5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제명: 국내 IB바이러스 변이유형 감시 모니터링
1. IBV 국내분리주의 유전형 분석 및 병원성형 분석
- 2011년 이후 국내 공식발생 362건을 축종별, 시기별, 지역별 발생 양상을 분석하였다. 축종별로는 육계(42.5%)와 토종닭(42.0%)에서 발생비율이 높았으며, 지역별로는 전북(39.0%), 경기(16.9%), 전남(11.3%), 충남(11.0%) 지역에서, 발생 시기별 분석에서 2월~7월 사이 (70%)에 상대적으로 발생 건수가 많았다.
- IBV 국내분
5. 최종 연구결과 요약
○ 제1세부과제명: 국내 IB바이러스 변이유형 감시 모니터링
1. IBV 국내분리주의 유전형 분석 및 병원성형 분석
- 2011년 이후 국내 공식발생 362건을 축종별, 시기별, 지역별 발생 양상을 분석하였다. 축종별로는 육계(42.5%)와 토종닭(42.0%)에서 발생비율이 높았으며, 지역별로는 전북(39.0%), 경기(16.9%), 전남(11.3%), 충남(11.0%) 지역에서, 발생 시기별 분석에서 2월~7월 사이 (70%)에 상대적으로 발생 건수가 많았다.
- IBV 국내분리주 134주의 S1 전체 유전자(약 1.7kb) 계통분석을 실시한 결과, 최소한 7개의 유전형이 존재하였으며 이 중 KM91(38주, 28.3%), QX형(30주, 22.3%), 재조합 신장 형(rec KII)형 (24주, 17.9%), K1형(24주, 17.9%)이 국내 주된 타입으로 확인되었다.
- 계종별 유행바이러스 타입을 분석하였을 때, 모든 계종에서 신장형 IB가 주된 유행 타입 (76.1%, 117/155)었으며, 호흡기형 IB는 산란계에서 다른 계종에 비해 상대적으로 발생비율이 높았다.
2. IBV 국내 분리주의 시기별 바이러스 유행형 변화 추이분석
- 상기에서 S1 전체 유전자를 바탕으로 분석한 IBV 134주의 유전형 결과를 바탕으로, 시기별 IBV 유행변화 추이를 분석한 결과, 신장형 IB의 경우, 2000년 초반까지 KM91형이, 그 이후 2000년대 중반에는 QX형이, 2000년대 후반에는 KM91형과 QX형의 재조합형(rec KII)이, 2010년대 이후에는 KM91형 IB와 QX형 IB이 주된 유행하는 경향을 보였다.
- 호흡기형 IB의 경우 한국형(K1형) IBV는 1986년 이후 지속적으로 발생하는 경향을, Mass 형 IBV는 2000년대 중후반까지 간헐적 발생 경향을, 중국 TC07-2형 IBV의 경우, 2000년 대 후반에 발생이 증가하는 경향을 보였다. 중국 Q1형은 2005년 1건의 발생만 있었다.
3. IBV 국내 분리주의 유전자 변이양상 분석
- IBV 국내 분리주 149주의 S 유전자 전체(약 3.5kb)의 유전자 염기서열을 분석한 결과, 유전형간 유전자 재조합 호발부위는 S1 HVR부위가 아닌 S1 중간 부위(positions 600-1200) 인 것으로 분석되었다. 이러한 결과로 인하여, IBV 유전형의 구분은 S1의 중간 부위 또는 S1 전체 유전자로 계통분석을 했을 때 유전형 분류가 명확하게 나타났다. IBV S1의 HVR 부위는 신장형 IBV 유전형 구분이 명확하지 않았고, S1 후반 부위(positions 1200-1600) 에서는 재조합 신장형의 구분이 명확하지 않았다.
- IBV S2 부위는 IBV 타입(신장형, 호흡기형 등)과 관계없이, 중국과 한국 등 동아시아에서 주로 발생하는 IBV 분리주들은 모두 같은 common 그룹으로 분류되었으며, Mass 타입과 중국 TC07-2 타입은 이들 common 그룹과는 구분이 되었다.
- IBV 국내 분리주 149주에 대하여 상기의 S1 전체 유전자의 재조합 양상을 분석한 결과, 전체 분리주의 18.8%(28주)에서 바이러스 유전형 간 유전자 재조합이 발생하였으며, 그 중 82.1%(23주)가 신장형(중국QX타입과 KM91타입) 바이러스 간 재조합이었으며, 신장형과 호흡기형간 유전자 재조합 비율은 2.7%(4주)였다.
4. IBV 국내 분리주 주요 스트레인의 전장유전자 분석
(1) 국내 시기별 IBV 전장유전자 비교분석
- 1990년대 1주, 2000년대 초반 1주, 2000년대 중반 2주, 2000년대 후반 2주, 2010년대 2주 등 시기별 IBV 국내분리주 대표 스트레인 8주를 선발하여 전장 유전자(27,682-27,684nt) 를 분석하였다.
- 그 결과 2000년대 이후 QX유사 IBV 국내 분리주는 KM91 유전자 backbone에 중국 QX 형 IBV S1 유전자가 재조합된 형태로, 2000년대 중반 이후 S1 부위에서 국내 유행주와 QX IBV 타입간 추가적으로 재조합된 형태로, 그 이후 2000년대 후반에 중국 QX유사형 피구가 재유입되었던 것으로 분석되었다.
- 국내 분리주의 전사조절유전자(TRS) 비교분석 결과, leader TRS에서 동일한 염기서열 (CTTAACAA)을 가지고 있었으며, Body TRS의 경우 TRS4(M), TRS6(N) 부위는 leader TRS 염기서열과 동일하였으나, 나머지 body TRS의 경우 국내 분리주마다 leader TRS 염기서열과 0-3개의 염기서열 불일치를 보였다.
- 국내 분리주의 S단백질 분절부위 아미노산 서열을 분석한 결과 국내분리주 4주는 RRFRR/S, 나머지 국내 분리주 4주는 HRRRR/S 아미노산 서열을 가지고 있었다.
- E 단백질의 소포체 잔류시그널(ER retiontion signal)의 경우 2009년 이전 국내 분리주는 RHGKLHS 아미노산 서열을, 가지고 있었다.
- M 단백질의 Ectodomain의 아미노산 서열의 경우 2010년 이후 최근 국내분리주 2주에서 이전 국내 분리주의 6번째 아미노산(E)이 결손되어 있었다.
(2) 대륙별 국가별 QX형 IBV 전장유전자 비교분석
- 아시아(중국 및 한국), 유럽(스웨덴, 이태리, 폴란드), 아프리카(수단, 남아연방) 등 대륙별 국가별 유행초기 QX형 IBV 대표 스트레인의 전장유전자를 비교분석한 결과, 중국 바이러스와 그 외 바이러스 간에는 장유전자를 제외한 부위에서 상동성이 현격하게 낮았다
- 중국 스트레인은 기존 상재바이러스 backbone에 출처 불명의 장유전자와 오리 코로나바이러스로 추정되는 3a유전자가 재조합되어 출현한 것으로 분석되었다.
- 한국 스트레인의 경우, 90년대 이후 한국에서 유행한 KM91형 신장형 IBV의 backbone에, QX-like IBV S 유전자를 획득하여 재조합된 것으로 분석되었으며, 비구조 단백질 유전자 부위에서 백신주(H120) 및 칠면조 바이러스 유전자 재조합도 일어난 것으로 분석되었다.
5. IBV 분리주 유전형 감별 기법 개발 및 혼입 패턴 분석
- 국내 유행 IBV 유전형 중 호흡기형을 제외한 나머지형의 유전자 deletion에 착안하여 호흡 기형 감별 검출 기법을 개발하였다. 이를 국내 분리 IBV 59주에 적용한 결과, 38주의 바이러스에서 호흡기형 IBV의 유전자가 검출되어 predominant genotype과 다른 유전형의 minor population이 높은 비율로 존재함을 확인하였다. 또한, 신장형보다 호흡기 친화형의 바이러스에서 보다 높은 비율로 혼입되어 있었다. 실제 신장형과 호흡기형 사이의 유전자 재조합주가 빈번하지 않은 것으로 보아 향후 heterogenous population이 재조합 변이 주 출현에 미치는 영향을 분석할 필요가 있을 것으로 판단되었다.
6. IBV 중화항체 제작 및 교차 중화능 평가
- IBV 중화시험을 통한 항원지도 작성을 위해 높은 중화능의 항혈청 생산기법 확립을 시도하였다. 1차 점안 접종 후 2차 접종을 저역가 또는 고역가 바이러스 정맥 내 접종, 불활화 바이러스 근육접종법으로 구분하여 실시하였다. 2차 접종 2주 후 채혈하여 중화시험을 실시한 결과, 불활화 바이러스 근육접종 시 가장 높은 중화항체역가를 나타내는 것으로 나타났다.
7. QX 유전형 IBV 유전자 재조합 유형 분석 및 유형별 대표주 선발
- 2003~2019년 국내 IBV QX형 분리주(38주)에 대하여 장 전체 유전자 재조합 양상을 분석한 결과, 9가지 유형으로 나뉘어졌다. 신장형 유전자 간 재조합(QX cladel+QX cladeII(25 주,65.8%), QX cladeI+KM91(10주, 26.3%), QX cladeII+KM91(2주, 5.3%)), 신장형과 호흡기간 유전자 재조합 1주(QX cladeII+KI, 2.6%)이 발생된 것으로 분석된 결과, 신장형과 호흡기 간의 재조합보다 신장형 타입 간의 재조합이 더 빈번하게 발생하는 것으로 나타났다.
- 상기의 결과를 바탕으로 신장형 유전자간 재조합 유형별 대표주 7주(Kr_AD062_16, Kr_AD042_18, Kr_AD049_18, Kr_AD051_18, Kr_AD017_18, Kr_AD108_18, Kr_AD001_19)을 선발하였다.
8. QX/rQX 유전형 국내 분리주의 닭에서의 병원성 조사
- QX/rQX 유전형 대표주(7주)의 닭 병원성을 평가하기 위하여 임상증상 scoring, Tracheal ciliostasis score 및 lesion score, 바이러스 배출능(Virus shedding) 및 조직 내 항원분포 (Tissue distribution) 등을 토대로 분석을 실시하였다.
- 모든 감염군에서 접종 후 3일에는 임상증상이 나타나지 않았으나, 7일 이후 임상증상이 지속적으로 관찰되었다. 그 중 Kr_AD001_19 감염군에서 폐사가 2마리 관찰되었다.
- 접종 3일 후부터 일부 감염군(Kr_AD042_18, Kr_AD049_18, Kr_AD051_18, Kr_AD108_18) 에서 기관에서의 조직 병변이 관찰되었으며, 접종 후 7일에는 모든 감염군의 기관에서 조직병변이 나타났다. 그러나, 신장에서의 조직 병변은 모든 감염군에서 관찰되지 않았다. KII가 신장 조직 병변이 약하게 나타나는 것에 비해, 최근 QX 분리주는 육안적 및 조직학적으로 병변이 관찰되지 않았다.
- 기관 병변지수는 최근 QX 유전형 분리주(0.3~3)가 KII(0.2~1.2)에 비해 다소 높았으며, 바이러스는 21일까지도 지속적으로 검출되었다.
- 접종 후 21일까지 IBV 바이러스가 장관계통 장기(proventriculus, duodenum, cecal tonsil)에서 지속적으로 검출되었으며, KII보다 장관계통에 더 친화성이 있다는 것이 관찰되었다.
O 제2세부과제명: 국내유행 IB바이러스 타입별 교차방어능 평가
1. IBV 유전형별 대표주 선발
- 국내유행 IBV 바이러스 분리주 중 신장형 바이러스 유전형별 2종, 호흡기형 바이러스 유전형별 2종, 기타 유전형 2종 등 총 6종의 대표균주를 선발하였다.
2. IBV의 닭 병원성 평가지표 설정
- IBV 분리중의 닭 병원성을 수치화하여 평가할 수 있도록, 병웜성을 평가하기 위한 평가 지표를 설정하였다. 설정한 병원성 평가 지표로는 분자유전학적 지표(S1 전체 유전자의 계통 분석에 의한 유전형 분류), SPF닭 감염실험을 통한 임상평가 지료로는 임상증상 scoring, Tracheal ciliostasis score 및 lesion score, 바이러스 배출능(Virus shedding) 및 조직 내 항원분포(Tissue distribution) 등이다.
3. TC07-2 유전형 국내분리주의 닭에서의 병원성 조사
- TC07-2 유전형은 2007년 중국에서 처음 출현한 TC07-2형 IBV 국내분리주에 대한 상기의 평가지표를 토대로 닭 병원성 분석을 실시하였다.
- 감염군에서의 임상증상은 접종 후 5일부터 9일까지 뚜렷하게 관찰(score 2.0)되었으며, 관찰기간인 14일까지 호흡기 임상증상은 지속적으로 관찰되었다. 접종 후 3일과 7일째 섬모의 운동성을 완전히 소실하였고 14일째에 섬모 운동성을 회복하였다. 기관에서의 조직 병변이 접종 후 5일과 7일 째 집중적으로 관찰되었다.
- 감염군에서의 바이러스의 배출을 구강을 통해서 접종 3일부터 9일까지 배출되었으나, 총배설강을 통한 바이러스 배출은 접종 후 7일에서만 확인되었다. 감염군의 내부 장기 조직에서의 IB 바이러스의 분포는 접종 후 3일에 기관, 폐, 신장 및 선위에서 검출 된 것으로 시작으로 7일에는 명장편도에서 또한 검출 되었다. 14일에는 기관, 폐, 신장 및 맹장편도에 서 관찰되었고, 21일에는 폐와 신장, 맹장 편도에서 검출되었다.
4. Q1 유전형 국내분리주의 닭에서의 병원성 조사
- Q1 유전형은 1996년 중국 전역에서 닭의 선위염 증상과 관련하여 보고된 신종 타입 바이러스로, 이후 2000년대 초반이후 대만, 한국, 중동, 이탈리아, 베트남 등에서 분리보고가 있었다. 국내 분리 빈도는 매우 낮지만 동남아시아 지역에서 유행이 확인됨에 따라 국내 재유입을 대비하여 병원성을 평가하였다.
- 분자유전학적 평가(IBV 유전형) 지표: Q1형 IBV 국내분리주는 S1 전체유전자 계통분석에서 명확하게 Q1형으로 분류되었다.
- 접종 후 7일~14일까지 호흡기 증상만 관찰되었고, 조직 병변 역시 기관에만 국한되었다(기관 상피 소실, 점막 고유층 염증 세포 침윤 등).
- 바이러스의 배출은 접종 3일부터 21일까지 구강으로 이루어졌고, 총배설강의 경우 접종 후 9일째부터 21일째까지 검출되었다. 접종 후 3, 7, 14, 21일째 장기별로 바이러스를 검출 한 결과, 접종 후 3일에 선위에서 검출된 것으로 시작으로 7일에는 기관, 신장, 선위, 맹장 편도, 및 십이지장의 대부분의 장기에서 검출되었다. 14일에는 어떠한 장기에서도 검출되 지 않았으며, 21일에는 일부 개체의 신장에서만 검출되었다.
5. QX 유전형 국내분리주의 백신 방어효능 평가
- 최근 발생률이 증가하고 있는 QX 유전형(신장형) 분리주에 대한 KII(신장형) 백신의 방어능을 확인하기 위하여 KII(신장형) 백신 1회(1일령 또는 6~8일령) 및 2회 접종(1일령 및 6~8 일령)하고, 2주 후 rQX(Kr_AD049_18)를 공격접종(점안)하였다.
- 방어효능 비교를 위하여 ciliostasis, lesion score, antigen detection(trachea, kidney)등을 조사하였다.
- 공격접종 후 5일째 기관(75~100%)내 바이러스가 확인되었고, 신장에서도(20~80%) 바이러스가 확인되었으나, 주요 호흡기 증상·설사 등의 임상증상과 폐사는 확인되지 않았다.
(출처 : 요약 1p)
Abstract
▼
Infectious bronchitis virus (IBV) is a highly contagious respiratory pathogen of chicken and cause significant economic loss due to poor production performance in poultry industry around the world. Different serotypes and genetic types of the IBV have been identified and for the most part do not cro
Infectious bronchitis virus (IBV) is a highly contagious respiratory pathogen of chicken and cause significant economic loss due to poor production performance in poultry industry around the world. Different serotypes and genetic types of the IBV have been identified and for the most part do not cross-protect. Additionally new types of the virus continue to arise due to mutation and recombination events in the viral genome.
The TC07-2-like(KrD1515) and Q1-like(KrD0564) genotypes of IBV was isolated in 2015 and 2005, respectively, in Korea. Pathogenicity and tissue tropism of the Korean Ql-like and TC07-2-like IBV were evaluated using specific pathogen free (SPF) chickens, both KrD1515(between a TC07-2 and Korean IBVs) and KrD0564(between Q1 and Massachusetts) is a recombinant virus and engages in respiratory tropism in chickens.
We noted that viral genetic mutations and recombination events commonly gave rise to distinct IBV genotypes. The potential recombinant events of the QX-like genotype of IBV were carried out using SimPlot software. Recombination analysis of QX-like genotype showed 8 patterns. As a results, recombination between nephropathogenic and nephropathogenic strains occurs more frequently than recombinant between nephropathogenic and respiratory strains.
Commercial vaccines(KII) were evaluated against QX-like genotype of IBV. Ciliostasis, antigen distribution and lesion score were evaluated at day-5 after challenge. In conclusion, KII vaccinated chickens were not protected from QX-like genotype of IBV. These results indicate that the continuing evolution of IBVs by genetic drift and genetic recombination may lead to IBV outbreaks even among the vaccinated chickens.
(출처 : Abstract 40p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- I. 연구배경 및 목표 ... 6
- 1. 연구배경 ... 6
- 2. 연구최종목표 ... 7
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
- II. 연구방법 및 수행전략 ... 8
- 1. 재 료 ... 8
- 2. 연구전략 및 방법 ... 8
- III. 연구결과 ... 9
- IV. 연구결과요약 ... 31
- V. 고 찰 ... 36
- VI. 참고자료 ... 37
- VII. 영문초록 ... 40
- 끝페이지 ... 40
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