초록 ▼

4. 당해년도 연구결과 요약

○ 세부과제명: 엑솜 시퀀싱 데이터 기반 유전체 분석(Whole exome sequencing, WES)을 통한 CWD 신규예측 표적 탐색
- CWD 감염 사슴 뇌유제를 TgElk 마우스에 뇌내접종하여, 잠복기가 107±20일째 전형적인 임상증상이 관찰되었고, 공격률은 100%로 실험결과 양성을 나타내었음. CWD 감염개체 뿐만 아니라, 정상 마우스에서 혈액 시료를 확보하여, genomic DNA를 정제함.
- 3개 샘플에 대해 exome library 제작을 위한 QC를 적용하여

4. 당해년도 연구결과 요약

○ 세부과제명: 엑솜 시퀀싱 데이터 기반 유전체 분석(Whole exome sequencing, WES)을 통한 CWD 신규예측 표적 탐색
- CWD 감염 사슴 뇌유제를 TgElk 마우스에 뇌내접종하여, 잠복기가 107±20일째 전형적인 임상증상이 관찰되었고, 공격률은 100%로 실험결과 양성을 나타내었음. CWD 감염개체 뿐만 아니라, 정상 마우스에서 혈액 시료를 확보하여, genomic DNA를 정제함.
- 3개 샘플에 대해 exome library 제작을 위한 QC를 적용하여, QC기준을 통과하는 샘플에서 Novaseq6000으로 Running을 진행하였음.
- NGS 기술을 이용하여 사슴유래 CWD 감염 마우스의 WES 실험을 수행하였으며, WES 분석 데이터를 바이오인포매틱스 툴을 이용하여 기본 데이터 분석을 진행하고, 전체 샘플에 대한 coverage의 검증과 Histogram of depth distribution in target regions의 검증 결과를 적용하여 최종 결과 데이터를 추출하였음.
○ 세부과제명: 사슴 CWD 마우스 감염 혈액에서 백혈구제거 필터를 적용한 감염력 평가
- 혈액학적 데이터는 생체시료의 중요한 지표로 사슴의 혈구분석뿐만 아니라, 프리온질병을 일으키는 다른 축종(소, 염소), 실험에 적용되는 사슴유래 마우스에 대해 자동혈구분석기를 이용하여, 혈액내 일반혈액검사(CBC)를 진행하였음. 엘크 사슴의 경우, 연령별(3~5세이상) 개체수 (n=3 이상)에 대해 분석을 실시한 결과, 연령별 혈구분석에서 통계적 유의성에 차이가 없음을 확인, 연령에 따른 그룹간의 혈구수치 특성이 비슷함을 알 수 있었음. 소, 염소 및 마우스의 경우 leukocytes계의 변동계수를 살펴본 결과, 총 백혈구(WBC)는 각각 27.89%, 22.65%, 18.36%로 개체간의 총 백혈구수는 안정적으로 측정이 되었고, erythrocytes계의 혈구들의 지표들은 안정적인 검출 결과를 나타내었음.
- 국내·외에서 개발되어 상용화되어 있는 백혈구제거 혈액필터 2종(헤모네틱스사 필터 RC2VAE, 코오롱 인더스트리사 필터 FINECELL WF-300)을 대상으로 정상마우스 혈액을 이용하여, 채혈 후 2시간 이내에 여과를 실시하였음.
: 여과시간은 헤모네틱스사(혈액 40ml 기준)와 코오롱인더스트리사(혈액 36ml 기준)의 백혈구 제거 혈액필터의 경우, 각각 2분 35초, 2분 10초로 확인이 되었음.
- 혈액여과 전•후 FACS를 이용하여, 잔여백혈구 수와 백혈구 제거율을 평가하였음.
: 잔여백혈구 수는 헤모네틱스사 혈액필터의 경우 3.9x10⁵/unit, 코오롱인더스트리사 혈액 필터는 0.8x10⁵/unit로 측정되어, 모두 만족(유럽 기준〈1x10⁶/unit)하는 백혈구 제거능을 보였음. 2종의 백혈구 제거 혈액필터의 백혈구 제거율은 각각 99.815%, 99.926%로, 서로 비슷함을 확인할 수 있었음.
- 추가로 앞서 획득한 여과 전·후 혈액(1 ml)에 대해 CBC 검사한 결과, 백혈구의 수가 현저하게 떨어짐을 확인, 이는 FACS를 통해 나타난 혈액여과 후 백혈구 수의 감소 결과와 유사함을 보였음.
- 정상 형질전환 마우스 혈액을 통해 확립된 여과방법을 CWD 감염 마우스 혈액에 대해 적용하기 위해 CWD 변형프리온을 뇌내접종하여, CWD 변형프리온 감염이 확인된 시점(90dpi)에서 혈액을 채취하였고, 여과 전·후 혈장샘플을 확보하였음. 또한 CWD 프리온을 사슴 정상혈액에 spike하여 여과 전·후 혈장 시료에서 RT-QUIC을 이용한 프리온 잔존 유무 평가를 실시한 결과, 여과 후 10^-5에서 변형프리온이 검출되지 않았음.
- 백혈구제거 혈액필터(2종)를 사슴 혈액에 적용한 결과, 헤모네틱스사(혈액 115 ml 기준)와 코오롱인더스트리사(혈액 100 ml 기준)의 백혈구 제거 혈액필터의 경우, 각각 4분 41초, 5분 48초로 확인. 잔여백혈구 수는 헤모네틱스사 혈액필터의 경우 5.0x10⁵/unit, 코오롱인더스트리사 혈액필터는 0.2x10⁵/unit로 측정, 백혈구 제거율은 각각 99.889%, 99.994%로 확인. 최종 헤모네틱사 필터를 이용하여 2018/19년 CWD 발생 농장의 음성 혈액시료(n=13)를 대상으로 백혈구 제거 여과방법을 확립. 백혈구제거 혈액필터의 여과시간은 평균 4분 2초였으며, 잔 여백혈구 수는 3.95x 10⁵/unit로 측정되어, 만족하는 백혈구 제거능을 보였음.

(출처 : 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1I. 연구배경 및 목표 ... 3 1. 연구배경 ... 3 2. 연구최종목표 ... 5 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5II. 연구방법 및 수행전략 ... 7 1. 재 료 ... 7 2. 연구전략 및 방법 ... 7III. 연구결과 ... 8IV. 연구결과요약 ... 28V. 금후 추진계획 ... 29VI. 참고자료 ... 29끝페이지 ... 31