보고서 정보
주관연구기관 |
농림축산검역본부 Animal and Plant Quarantine Agency |
연구책임자 |
박영일
|
참여연구자 |
구현옥
,
이희
,
강석진
,
황소련
,
강환구
,
송재영
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2016-12 |
과제시작연도 |
2016 |
주관부처 |
농림축산식품부 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA) |
등록번호 |
TRKO202000030875 |
과제고유번호 |
1545011833 |
사업명 |
농림축산검역검사기술개발 |
DB 구축일자 |
2020-11-21
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키워드 |
역분화줄기세포.간장독성.세포모델.동물용의약품.
|
초록
▼
4. 최종 연구결과 요약
□ 제1세부과제명: 인체 줄기세포의 간장세포 분화 다양성 분석 및 분화효율 증진
1. 줄기세포주 수집 및 특성 분석
1) 인체 배아줄기세포 및 역분화줄기세포주 수집
◦ 배아줄기세포 1종 (WA01) 및 역분화줄기세포 5종 (AiPS, iPS(IMR90)-1, QIA7, QIA11 WT-iPS3)
2) 인체 줄기세포 특성 분석
◦ 6종의 줄기세포의 표현형 분석
- 전형적인 배아줄기세포 형태를 나타냄 (Matrigel-coated plate)
- 모든 세포주에서 배아줄
4. 최종 연구결과 요약
□ 제1세부과제명: 인체 줄기세포의 간장세포 분화 다양성 분석 및 분화효율 증진
1. 줄기세포주 수집 및 특성 분석
1) 인체 배아줄기세포 및 역분화줄기세포주 수집
◦ 배아줄기세포 1종 (WA01) 및 역분화줄기세포 5종 (AiPS, iPS(IMR90)-1, QIA7, QIA11 WT-iPS3)
2) 인체 줄기세포 특성 분석
◦ 6종의 줄기세포의 표현형 분석
- 전형적인 배아줄기세포 형태를 나타냄 (Matrigel-coated plate)
- 모든 세포주에서 배아줄기세포 마커 단백질인 NANOG와 OCT4가 95% 이상 발현됨
- 배아줄기세포 특이 유전자 (NANOG, OCT4, REX1) 발현에서 세포주간 차이 확인
。줄기세포의 유전 특성 분석 (PCR array)
- 6종 줄기세포에서 배아줄기세포 특성,분화 및 신호전달 관련 유전자 발현 차이 확인
2. 줄기세포주의 간장세포 분화유도 단계별 다양성 분석
1) 줄기세포의 간장세포 분화
。줄기세포의 체외 간장세포 분화유도
- 4단계 분화법에 의한 줄기세포의 간장세포로 분화유도
◦ 진정내배엽분화단계 (Stage I)에서 세포간 분화차 확인
- 기존의 진정내배분화단계는 100ng/mL Activin A (A100) 에 의해 분화유도
- 줄기세포주간 진정내배엽 마커 유전자 (SOX17, FOXA1, CXCR4)의 발현차이 확인
◦ 최종 분화단계 (Stage IV; 간장세포 성숙)에서 분화된 간장세포의 형태 및 알부민 분비능에서 세포간 차이를 확인
3. 줄기세포의 간장세포 분화효율 증진을 통한 간장세포 모델 확립
1) WNT 신호조절을 통한 진정내배엽세포 분화효율 증진
◦ WNT 신호 조절자인 WNT3A, CHIR99021 처리 후 세포 생존율 측정
- WNT3A 처리군에서 2종 (AiPS와 WA01)을 제외한 세포주에서 대조군 (A100)과 비교하여 세포 생존율이 향상됨
- CHIR99021 처리군은 6종의 세포주에서 대조군 (A100)에 비해 세포 생존율이 향상됨
◦ WNT 신호 조절이 진정내배엽 분화에 미치는 영향
- 모든 세포주에서 90% 이상 진정내배엽 마커인 SOX17 발현함
- SOX17 유전자 발현에서는 WNT3A, CHIR99021 처리군에서 세포간 차이를 나타냄
- 세포 증식과 관련된 유전자 C-MYC의 발현이 CHIR99021 처리군에서 과발현
- 세포주기가 WNT3A와 CHIR99021 처리시 G1단계가 감소하고 S 및 G2/M단계는 증가함
。간장세포분화단계 (Stage IV)에서 분화효율 검증
- 알부민 분비양이 CHIR99021 처리군에서 유의적으로 증가 하지는 않았지만 세포간 분비량이 균일화됨
2) WNT 신호 조절 관련 유전자의 변화 (PCR array)
◦ 세포 생존율에서 큰 차이를 나타낸 AiPS와 QIA11 세포주 mRNA을 이용하여 WNT 신호관련 유전자 발현 비교분석
- 2종의 세포주에서 대조군 (A100)과 WNT3A 처리군간 유전자 발현에 큰 차이 없음
- CHIR99021 처리군에서 WNT 신호관련 유전자 발현 변화가 매우 큼
3) WNT 신호조절 후 간장세포성숙 단계에서 분화능 확인
。진정내배엽단계에서 WNT3A 및 CHIR99021처리에 따른 분화능 비교
- 알부민 분비양이 증가하지는 않지만 세포주간 분비양의 균일성을 나타냄
- 세포주간 간장세포 형태에는 여전히 차이를 보임
□ 제2세부과제명: 인체 줄기세포유래 간장세포 이용한 동물용의약품 등의 간기능 및 간암 유발성 평가
1. 분화 간장세포를 이용한 동물용의약품 등의 간장세포발달에 미치는 영향 평가
1) 약물선정 및 인체줄기세포의 간장분화유도
◦ 공시약물; 아플라톡신 B1 (AFB1)
◦ 공시세포; 인체줄기세포주(WA01, QIA7)로부터 분화된 간장세포유도단계(Stage III)의 세포
2) 줄기세포의 간장세포 분화 및 특성검증
◦ 간장전구세포의 간장세포 분화단계 (Stage III, 7일) 검중
- 간장세포 마커단백질 (Albumin,DLK1, E-Cadherin)의 증가
- 간장세포유도단계 (Stage III)에서 알부민과 urea 분비가 낮은 수준에서 점차 중가
- 간장세포성숙단계 (Stage IV)에서 알부민과 urea 분비가 급격하게 증가함
3) AFB1의 간장세포 발달에 미치는 영향 평가
◦ 줄기세포의 간장세포유도단계 (Stage III)에서 세포독성 평가
- Stage III 전 기간 (7일)동안 AFB1 처리를 통한 농도설정;0, 3.1, 6.3, 12.5 uM
- HCS (high content screening)를 통한 세포내 다기능 평가 ;Fluo-4AM (calcium influx) 은 증가, TMRM (mitochonderial membrane potential) 및 BODIPY (oxidative stress)는 감소
◦ 줄기세포의 간장세포 유도단계에서 발달독성 평가
- 약물 처리를 통한 간장세포특이 유전자의 발현 ; AFB1 은 분석한 간장세포 특이 유전자 8종 (A1AT, AFP, ALB, GSTA1, HNF1A, HNF4A, TAT, TTR)에서 모두 감소하는 경향을 나타냄
- 간장세포 특이 유전자 (HNF1A, HNF4A, Albumin)는 Stage III 분화기간중 대조군 (DMSO)에서는 유전자 발현이 증가하지만 비독성 농도 AFB1 처리군은 감소함
- 간장세포 특이 유전자 (HNF1A, HNF4A, Albumin) 프로모터 부위의 DNA 메틸레이션 (methylation)에서 대조군 (DMSO)은 전체 DNA 메틸레이션이 감소하지만 비독성 농도 AFB1 처리군은 변화가 없음
2. 분화 간장세포를 이용한 동물용의약품 등의 발암 유발성 평가
1) 약물선정 및 인체줄기세포의 간장분화유도
◦ 공시 약물; 아플라톡신 B1 (AFB1), 니트로소디에틸아민 (DEN), 니트로플라존 (NFZ), 플루메퀸 (FM)
◦ 공시세포; 인체배아줄기세포주로부터 분화된 간장세포유도단계 (Stage III)의 세포
2) 간장세포유도단계 (Stage III)에서 약물에 대한 간암 유발성 평가
◦ 세포독성 및 처리농도 선정
-IC50; AFB1 (29.6 μM), DEN (11 mM), NF2 (278 μM), FM (928 μM)
-IC12.5; AFB1 (5.7 μM), DEN (6.2 mM), NFZ (104 μM), FM (225 μM)
-처리농도; 비독성 농도 (약 IC12,5 농도를 최고농도로 함)
;AFB1(0-12.5 μM), DEN (0-10 mM), NFZ (0-100 μM), FM (0-250μM)
◦ 세포주기 (cell cycle) 분석
-AFB1 과 DEN은 처리농도 범위내에서 세포주기의 변화를 나타내지 않음
-NFZ과 FM에서 <2n 비율 (%)이 감소하고 2N/4N (S phase)과 4N (G2/M phase) 세포비율이 증가함
-Ki67 양성반응 세포수가 NFZ과 FM에서 증가함
-세포주기 관련 유전자 발현
◦ 발암관련 유전자 분석
-C-MYC의 발현이 NFZ과 FM에서 증가함
-TP53, IL6, IKKB, NF-kB 그리고 TNFa에서 유의한 발현을 찾을 수 없음
(출처 : 4. 최종 연구결과 요약 1p)
Abstract
▼
Recently, pluripotent stem cells (PSCs) such as embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been considered as an alternative toxic testing model.
For evaluating hepatotoxicity of veterinary drugs, several protocols of multi-step hepatic differentiation have been
Recently, pluripotent stem cells (PSCs) such as embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been considered as an alternative toxic testing model.
For evaluating hepatotoxicity of veterinary drugs, several protocols of multi-step hepatic differentiation have been reported to recapitulate the in vivo hepatic development. In our previous study,in vitro hepatic differentiation methods based on Activin A (100ng/mL) have been established in human and mouse ESCs and iPSCs. However, it was difficult to apply the protocol to other types of PSCs due to distinct differentiation potential derived from inter-individual variation. Therefore, standard protocol is needed to evaluate hepatotoxicity of veterinary drags using stem cell model. Here, to establish the standard protocol of in vitro hepatic differentiation, we based on our previous condition of hepatic differentiation consisted with four stages (Stage I - IV) and six stem cell lines (one ESCs and five iPSCs). Differentiation of stem cells to hepatocytes was controlled by WNT3A and CHIR99021 related with WNT signaling during Stage I of differentiation. After treatment of each factor, cell cycle and C-MYC expression were increased at Stage I and cell viability was uniformed among the cell lines as compared with no treatment. In particular, CHIR99021 affected cell viability and differentiation (expression of WNT signaling-related genes) at Stage I more than WNT3A. In the further study, amounts of albumin secreted at Stage IV (hepatic maturation; final stage of differentiation) were similar among the cell lines under CHIR99021 treatment. Based on our results, CHIR99021 effectively induced stem cells to hepatocyte-like cells by improving efficiency of cell differentiation at Stage I.
In the future study, it will need further characterization and comparison of hepatocyte-like cells originated from each stem cell line (i.e.,drug metabolic enzymes). Under the optimized protocol of in vitro hepatic differentiation with CHIR99021, human PSCs were induced to hepatocyte-like cells. We evaluated effects of chemicals (aflatoxin B1,DEN, nitorfurazone, flumeqine) during hepatic development of Stage III (hepatic specification; hepatic progenitor cells to hepatocytes); chemical toxicity (WST assay), expression of hepatocyte-specific genes and DNA methylation (HNF1A,HNF4A and Albumin). In addition, carcinogenic effects were investigated by estimating mainly changes of cell cycle, C-MYC expression and Ki67-positive cells. Collectively, we observed that aflatoxin B1 significantly affected hepatic specification by changes of DNA methylation in HNF1A, HFN4A and Albumin. In the further study, it will need for elucidating specific mechanism of DNA methylation. We did not observe carcinogenic effects of four chemicals even though it partially showed the increases of cell cycle,C-MYC expression and Ki67-positive cells in nitrofurazone and flumeqine as concentration-dependent manner. Collectively, stem cell-induced hepatocytes could be effectively induced by CHIR99021 and their characteristics were uniformed. Also, stem cells apply for evaluating toxicity of chemicals on the hepatic development of hepatocyte progenitor cells to hepatocytes. However, it needs an additional validation for modeling evaluation of carcinogens using stem cells.
(출처 : 영문초록 22p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- I. 연구배경 및 목표 ... 4
- 1. 연구배경 ... 4
- 2. 연구개발의 최종목표 ... 5
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
- II. 연구방법 및 수행전략 ... 6
- 1. 재 료 ... 6
- III. 연구결과 ... 7
- 1. 제1세부과제명; 인체 줄기세포의 간장세포 분화 다양성 분석 및 분화 효율 증진 ... 7
- 2. 제2세부과제명; 인체 줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 간기능 및 간암 유발에 미치는 영향 ... 13
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 18
- 1. 줄기세포주 확보 및 특성 분석 ... 18
- 2. 줄기세포주 개체별 간장세포 분화 다양성 분석 ... 18
- 3. 줄기세포의 간장세포 분화효율 증진을 통한 간장세포 분화 최적화 모델 확립 ... 19
- 4. 인체 줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 간암 유발에 미치는 영향 ... 19
- Ⅴ. 고 찰 ... 19
- VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 21
- VII. 참고문헌 ... 22
- VIII. 영문초록 ... 22
- 끝페이지 ... 23
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