초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제명: 야생조류 및 반추수에서 콜린에스터라제(ChE) 활성도 검사법 표준화 및 기본값 구축
1) ChE 활성도 검사법 개요
○ ChE 활성도 검사법 (Modified Ellman's method)의 원리: 기질 (Acetylcholine or Butyrylcholine)을 첨가하여 시료내의 콜린에스터라제에 의해 가수분해된 choline의 양을 colorimetric 혹은 fluorescence법으로 측정하여 시료내의 콜린에스터라제 활성도를 평가
○ ChE 활성도 검사 방법

5. 최종 연구결과 요약
가. 제1세부과제명: 야생조류 및 반추수에서 콜린에스터라제(ChE) 활성도 검사법 표준화 및 기본값 구축
1) ChE 활성도 검사법 개요
○ ChE 활성도 검사법 (Modified Ellman's method)의 원리: 기질 (Acetylcholine or Butyrylcholine)을 첨가하여 시료내의 콜린에스터라제에 의해 가수분해된 choline의 양을 colorimetric 혹은 fluorescence법으로 측정하여 시료내의 콜린에스터라제 활성도를 평가
○ ChE 활성도 검사 방법
- STD 준비→뇌(혈액)시료 준비→Reaction mix 및 Background mix준비→측정
〇 ChE 활성도 계산법
- 표준곡선에서 구해진 Optical density와 Choline농도간의 관계식으로부터 콜린에스터라제의 활성도를 산출
〇 시료에서의 AChE 활성도 정량 및 중독증 판정
- 표준곡선과 직선회귀방정식을 이용한 AChE 활성도 (μmol/min/g(mL)) 산출
- 정상 AChE값의 표준편차X2 이하, 조류에서는 AChE 정상값의 50%이상 저하가 나타나면 유기인계 농약에 의한 중독증을 사인으로 규정
〇 시료에서의 BuChE 활성도 정량 및 중독증 판정
- 표준곡선과 4PL(4-Parameter linear regression) 회귀방정식을 이용
- 유기인계농약 외에도 BuChE의 저하를 일으키는 요인들이 AChE에 비해 다양하게 존재하며, 개체별 차이가 BuChE에서 크게 나타나므로 진단에 사용되는 데 어려움이 있음
〇 AChE 활성도 검사법의 반복성 측정
- 소 뇌조직에서 일간, 일내 시험결과의 반복성 측정 결과 변동계수가 일내 4%이내，일간 10% 이내로 반복성이 있었음
- 야생조류 뇌조직에서는 일간, 일내 시험결과의 반복성 측정 결과 변동계수가 일내 11%이내, 일간 13% 이내로 반복성이 있었음

2) ChE 활성도 검사법 표준화
A. 시료 채취
○ 뇌의 채취 부위별 차이 (대뇌/소뇌)
- 대뇌피질부위보다 소뇌부위에서 AChE 활성도가 25%가량 높게 측정되는 경향이 보였음
〇 혈액의 채취 부분별 차이 (전혈/적혈구/혈장)
- AChE 의 활성도 값은 49개 정상시료의 적혈구에서 0.50±0.11，전혈에서 0.37±0.10 μmol/min/ml로 적혈구에서 약 1.4배 높게 나타났음
B. 보관기간
〇 뇌시료의 보관기간에 따른 차이
- 야생조류 및 소에서 시료채취 직후 실온/냉장/냉동/초저온냉동의 조건에서 3주동안 보관하여 관찰한 결과，3주이내 단기간 보관 시 보관온도 및 보관기간에 따른 유의한 차이가 없었음
- 소의 경우 6개월간의 장기보관에 따라 실온에 보관한 시료에서는 현저한 활성도 차이가 나타 났음
- 소의 경우 초저온냉동(-80℃) 보관시 AChE활성도 저하가 가장 덜 나타남
- 야생조류의 경우 실온 및 냉동보관 시료에서 현저한 활성도 차이가 나타났음
- 야생조류의 경우 냉장 및 초저온냉동(-80℃) 보관시 AChE활성도 저하가 가장 덜 나타남
〇 혈액 시료의 보관기간에 따른 AChE 활성도 차이
- 시료채취 직후 -4℃ 보관 후 2주간 보존 시 적혈구의 AChE의 활성도가 최대 24% 감소하였음
C. 희석배수의 영향
〇 야생조류 뇌 시료의 희석배수에 따른 AChE 활성도 차이
- 희석을 실시하지 않은 경우 AChE 활성도가 평균 0.79 μmol/min/g로 나타났으나 10배 희석 시 평균 2.01 μmol/min/g로 약 2.5배 높은 값이 관찰되었음
D. 세척여부에 따른 차이 (적혈구)
- 세척한 군에서 2%가량 활성도 값이 증가하였고 표준편차는 25%가량 감소하였음

3) 축종별 뇌 및 혈액 등에서 ChE 활성도 조사 및 기본값 구축
〇 축종별 뇌 및 혈액에서 ChE 활성도 선행연구 조사
- 소 뇌의 경우 Ellman's method를 이용한 연구에서 2.6~3.41 μmol/min/g의 AChE 활성도 값을 나타냈음 (2008 AJAVA, 2007 Vet. Toxicol., 2013 Clin. Toxicol.)
- 유기인계 농약에 노출된 소 뇌의 AChE 활성도 값은 0.3~0.4 μmol/min/g을 나타냈음 (2013 Clin. Toxicol.)
- 소 혈액의 AChE 활성도 값은 전혈, RBC, 혈장에서 2.23, 2.1, 0.1 μmol/min/mL을 나타냈음 (2003 Bull. Env. Cont. Toxicol.)
- 야생조류의 경우 7.4~27 μmol/min/g으로 축종별 AChE 활성도 값이 다양했음 (1982 Bull. Env. Contam. Toxicol., 1988 J. wildlife dis., 2012 Israel J. Vet. Med., 2015 Clin. Toxicol. 등)
〇 야생조류 축종별 폐사체의 뇌에서 효소활성도 측정 및 기본값 설정 (조류질병과 협조시료)
- 청둥오리를 비롯한 야생조류 27종을 87마리를 검사하였음
- 청둥오리의 정상 AChE값은 9.06±1.10 μmol/min/g이었으며, 유기인계 노출 AChE값은 1.285±1.09 μmol/min/g 이었음
- 비둘기의 정상 AChE 값은 6.43 ±4.40 μmol/min/g이었으며 유기인계 노출 AChE 값은 4.05±4.07 μmol/min/g이었음
〇 소의 뇌에서의 효소활성도 측정 및 기본값 설정 (질병진단과 협조시료)
- 한우 및 젖소를 비롯한 반추류 뇌 92건의 AChE를 검사하였음
- 소뇌의 정상 AChE 값은 0.77±0.29 μmol/min/g이었으며，유기인계 노출 AChE 값은 0.20±0.07 μmol/min/g이었음
〇 소 혈액에서의 효소활성도 측정 및 기본값 설정 (질병진단과 및 도축장 협조시료)
- 소 혈액 총 181건 검사
- 소혈액 정상 AChE 값은 0.57±0.22 μmol/min/ml 이었으며，유기인계 노출 AChE 값은 0.03±0.01 μmol/min/ml 이었음
- 소 혈장에서 BuChE 활성도를 측정한 결과，평균 BuChE 활성도는 178.31±28.43 mU/mL로 측정되었음

나. 제2세부과제명: 실험동물에서 유기인계 농약 노출에 따른 뇌 및 혈액 등에서 효소 활성도 변화 조사
1) 농약 투여에 따른 조직에서의 잔류량 및 뇌/혈액에서의 ChE활성도 변화 상관성 조사
○ 실험군 및 실험방법: 8주령 SPF 닭 20마리를 5개군으로 나누어 페니트로치온(FTR) 200mg/kg을 투여 후 1，3, 5, 7, 14일간 혈액/간/위내용물에서의 FTR 잔류량 및 뇌/혈액에서의 ChE변화량을 측정함
○ 혈액/간/위내용물에서의 FTR 잔류량
- GC-MS를 이용한 FTR의 잔류량 분석법의 검출한계(LOD)는 혈액/간/위내용물 모두에서 0.313mg/kg이었으며 회수율은 혈액/간/위내용물에서 각각 80/91/91%였음
- 체내 FTR 잔류량은 혈액에서 투여 후 1일차에 2개체에서 각각 22, 5 mg/kg으로 나타났으며 위내용물에서 1일차에 2080±810mg/kg이 검출되었고 3일차에 6.2±5.0mg/kg이 검출되었음
〇 뇌/혈액에서의 ChE변화량
- 닭 뇌에서의 AChE 활성도는 투여 후 1일차에 대조군에 비해 54%로 감소하여 3일차에 60%, 7일차에는 110%로 회복하였음
- 닭 혈액의 혈장 BChE는 투여 후 1일차에 대조군에 비해 6%로 94%가량의 활성도 감소를 나타냈으며 3일차에 51%, 7일차에 97%로 회복하는 양상을 보였음
- 닭의 ChE 활성도 변화량은 혈장 내 BuChE 활성도가 급격한 감소(90%이상)를 보이고 후에 투여후 7일차까지 빠른 속도로 회복하여 정상값을 나타냈고 뇌의 AChE는 50%가량의 감소 를 보인 후 투여후 3일까지도 감소량이 유지되다가 이후 회복되는 양상을 나타냈음
- 혈장 내 BuChE 활성도는 개체차가 크고 농약노출 후 단기간에 회복하는 특성이 있는데 비해 뇌 AChE 활성도는 개체간 차이가 크지 않고 농약노출 시 활성도 억제가 비교적 오래 지속되어 조류(닭)의 유기인계 농약 중독증 지표로서 활용도가 높을 것으로 예상됨

2) 농약 투여용량에 따른 혈액에서의 AChE/BChE 활성도 변화량 조사
〇 실험군 및 실험방법: 6주령 랫드 12마리를 3개의 페니트로치온 투여용량군으로 나누어 각각 500/250/125 mg/kg을 투여 후 1, 3, 5, 7, 14일간 혈액 내 AChE/BChE 활성도 변화량을 측정함
- 500 mg/kg을 투여한 그룹에서는 그룹의 50%인 2마리가 각각 투여 1일，2일에 폐사함
- 모든 군에서 적혈구의 AChE의 변화는 투여 후 3일 째 가장 낮은 농도를 보였으며 고농도 (500mg/kg)투여군에서는 투여 후 7일째까지도 정상값의 22%로 억제된 활성도가 크게 회복 되지 않다가 투여 후 14일째에는 정상값의 80%까지 활성도를 회복하였음
- 혈장의 BChE의 변화는 투여 후 1일째 모든 군에서 가장 낮은 농도를 보인 후 투여 후 5일째에는 회복되는 양상을 보였음
- 생체지표로 사용될 수 있는 혈액 chE 중 적혈구 AChE 활성도가 혈장 BuChE 활성도에 비해 농약으로 인한 억제효과 지속시간이 길고 억제효과도 크므로 적혈구 AChE 활성도가 더 활용도 높은 지표로 가능할 것임

(출처 : 5. 최종 연구결과 요약 1p)

Abstract ▼

Evaluation of cholinesterase activities as biomarkers of organophosphate poisoning in wild birds and domestic ruminants (Determination of Brain Acetylcholinesterase Activities in Wild birds and Chickens Exposed to Organophosphate Pesticide)

Brain acetylcholinesterase (AChE) activity has been

Evaluation of cholinesterase activities as biomarkers of organophosphate poisoning in wild birds and domestic ruminants (Determination of Brain Acetylcholinesterase Activities in Wild birds and Chickens Exposed to Organophosphate Pesticide)

Brain acetylcholinesterase (AChE) activity has been used as a diagnostic marker for organophosphate (OP) intoxication. This study was focused to investigate the reference ranges of normal brain AChE activities and to compare the correlation between pesticide residue and the activity of AChE in experimental animals. The brain specimens from wild birds were obtained from avian disease division of our organization. The dissected whole brains were immediately stored at 4℃ refrigerator and measured AChE activities within a few days according to modification of the Ellman’s method. For animal studies, four groups of 8-week-old SPF chickens were administered with 200 mg / kg·bw of fenitrothion dissolved in corn oil. Brain and tissue samples (liver, blood, stomach content) were taken on days 1, 3, 7, and 14 after the administration for the analysis of AChE activities and residues of pesticide using GC-MS (Agilent 7890A) and LC-MS/MS (Shimatsu Shimadzu Nexera X2 / Absciex QTRAP 6500).

The AChE activities were ranged from 6.40 to 18.8 μmol/min/g in the normal brains of wild birds, which showed differences among the species. In OP-exposed wild birds, the activities were inhibited by 48.0% ~ 96.3%. In fenitrothion-treated chickens, the concentrations of pesticide in stomach were 65.4~74.3mg/kg, 1.4, 0.08, 0.04 mg / kg at 1, 3, 7 and 14 days after administration, respectively. The residues of fenitrothion in liver and plasma were 1.62 and 0.024 mg/kg at day 1 and negligible after day 3. Fenitrothion-treated chickens showed significant decrease of 60% of control AChE activities until day3, which showed recovered after day 7.

In this study, brain AChE activities were examined in 27 species of normal or op-exposed wild birds and fenitrothion-treated chickens. Pesticide residues were rapidly disappeared in the tissues, suggesting that the concurrence with the AChE assay can improve the reliability of diagnosis.

(출처 : Abstract 35p)

Evaluation of cholinesterase activities as biomarkers of organophosphate poisoning in wild birds and domestic ruminants (Determination of Brain and Blood cholinesterase activities in Organophosphate-Exposed cattle)

The use of organophospate(OP) compounds for pest control has caused intoxications and fatalities in a number of cattle in Korea. It has been widely accepted that brain cholinesterase (ChE) activity can be used as a diagnostic marker together with chemical detection of pesticide residues. As the reference values from different laboratories in different countries are not always corresponded, our own established reference values were required. This study is to established baseline level of normal brain and blood ChE activities in cattle by which can be used as reference value for the diagnosis of organophosphate pesticide poisoning in cattle. Brain tissues of cattle were provided from Animal Disease Diagnostic Division of our organization. Blood samples were provided by Animal Disease Diagnostic Division (n=33) and slaughter house located in Gyeonggido (n=45). All samples were collected between 2014 and 2015. The determination of ChE activities in samples was performed by modification of the Ellman’s method. To establish a standard method for measuring ChE activities in cattle, ChE activity changes in whole blood/plasma/RBC and storage effect were determined. The presence of organophosphate pesticides in the stomach content of each carcass was determined by GC/MS in Analytical Toxicology Laboratory, Veterinary Drugs & Biologies Division, in QIA. Normal brain and blood ChE activities in cattle were shown at 0.77±0.29 μmol/min/g and 0.57±0.22 μmol/min/ml, respectively. Organophosphate-exposed cattle revealed a significant decreased level of brain and blood ChE activities, such as 0.20±0.07 μmol/min/g and 0.03±0.02 μmol/min/ml, respectively.

ChE activities of erythrocyte were 1.4 times higher than that of whole blood. In this study, normal brain and blood ChE activity values together with depressed values caused by OP poisoning are first introduced in catde in Korea. The reference values could facilitate routine diagnosis and monitoring of OP-poisoning in cattle.

(출처 : Abstract 36p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• I. 연구배경 및 목표 ... 5
• 1. 연구배경 ... 5
• 2. 연구최종목표 ... 6
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
• II. 연구방법 및 수행전략 ... 7
• 1. 재 료 ... 7
• 2. 연구전략 및 방법 ... 7
• III. 연구결과 ... 9
• IV. 연구결과요약 ... 31
• V. 고 찰 ... 32
• VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 33
• VII. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 34
• VIII. 주요연구과제 변경사항 ... 34
• IX. 참고자료 ... 34
• X. 영문초록 ... 35
• 끝페이지 ... 36