초록 ▼

5. 최종 연구결과 요약

○ 세부과제명 : 가금시료별 metagenomics 적용 기법 확립
- 분변 희석액 등 양이 많은 시료에 대한 농축장비를 stirred cell로 결정하고 1차 시료전처리법 확립을 위해 SPF 닭 분변 희석액에 특징이 다른 3종 virus를 첨가한 후 각 실험 단계별 Ct값을 확인한 결과 세균 DNA 및 dead cell 등을 제거하기 위해 처리한 chloroform의 경우 AIV RNA 손상에 영향을 미치는 것을 확인하였으며 이 과정을 제외한 시료처리(희석, centrifuge, ultr

5. 최종 연구결과 요약

○ 세부과제명 : 가금시료별 metagenomics 적용 기법 확립
- 분변 희석액 등 양이 많은 시료에 대한 농축장비를 stirred cell로 결정하고 1차 시료전처리법 확립을 위해 SPF 닭 분변 희석액에 특징이 다른 3종 virus를 첨가한 후 각 실험 단계별 Ct값을 확인한 결과 세균 DNA 및 dead cell 등을 제거하기 위해 처리한 chloroform의 경우 AIV RNA 손상에 영향을 미치는 것을 확인하였으며 이 과정을 제외한 시료처리(희석, centrifuge, ultrafiltration 및 초원심분리) 과정을 통해 바이러스 입자 농축 조건을 확립하였으며 cDNA 합성 및 DNA증폭을 위해 Superscript choice system을 이용함
- 흡수불량증후군 양성 시료 4개와 정상 닭 분변 총 5개 시료에 대하여 확립한 전처리법을 적용한 결과 NGS실험이 가능한 농도와 순도의 산물 획득
- 야생조류 결장내용물(17건)에 확립한 전처리법을 적용한 결과 NGS실험이 가능한 농도와 순도, 종다양성의 산물 획득
- 대퇴골두 괴사증을 보인 닭 연골조직에 2가지 조직 전치리법을 비교한 결과 NGS실험이 가능한 농도와 순도의 산물을 획득

○ 세부과제명 : 전염성 선위염 및 흡수불량증후군 원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용
- 1년차에서 확인된 전염성 선위염 원인체에 대한 whole genome sequencing 결과, picornavirus중 새로운 genus인 megrivirus에 속하며 구조단백질부위가 기존 turkey hepatitis virus와 30% 미만의 상동성을 보여 같은 megrivirus내에서 다른 유전형으로 확인됨, 신속·정확한 진단을 위해 개발한 real-time RT-PCR법에 대한 정량곡선을 작성하고 4.7 copy의 검출한계값을 산출함
- 흡수불량증후군시료에서 증폭시킨 DNA를 shearing, library구축, High-throughput sequencing후 de novo Assembly한 결과 시료당 약 2GB의 시퀀스정보를 얻을 수 있었으며 NCBI 데이터를 기반으로 한 Blastn 분류를 통해 4개 시료에서 공통적인 원인체 바이러스 2종(Astrovirus, picornavirus) 및 2개 이상 시료에서 4종 바이러스(parvovirus, rotavirus, calicivirus, picobirnavirus)의 유전적 시퀀스 정보를 확인하였음
- 확인된 유전 정보를 이용하여 각 바이러스별 유전적 특성을 조사하고 이를 통해 유전자 진단법을 개발하였으며 특히 여러 병원체를 동시에 개발하기위한 multiplex법으로 응용하였으며 실제 가검물 시료에 적용한 결과 흡수불량증후군이 아닌 세균 또는 다른 바이러스질병으로 진단된 육계에서도 높은 검출율의 7종 바이러스들이 확인됨

○ 세부과제명 : 야생조류 조종별 결장조직내 세균 및 바이러스의 군집분석 및 새로운 조류 원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용
- 야생조류 결장조직 시료(17건)를 metagenomics로 분석한 결과 대체적으로 청둥오리, 흰뺨검둥오리, 가창오리가 서로 비슷한 세균군집 구성을 보였음. 큰기러기와 쇠기러기가 비슷한 양상을 보였으며 흰죽지는 다른 야생조류와는 확연히 다른 군집 구성을 가진 것으로 확인되었음.
- 야생조류 시료에서 총 35종의 병원성 세균이 분포하였으며 검출된 Enterococcus cecorum에 대한 유전학적 상동성을 확인하였음
- 야생조류 시료에서 바이러스 분석결과 Murine leukemia virus가 3건, Columba palumbus retrovirus 2주, goose hepatitis B virus가 2건 검출되었고 관상조류로 사육중인 앵무새에서 2주의 parrot hepatitis virus B가 확인되어 기존에 알려진 바이러스들과의 유전학적 상동성을 비교하였음
- 또한 닭 연골조직에 대한 metagenomics 적용 결과 Enterococcus cecorum, E. coli, Psudomonas 등 다양한 세균이 검출되었음

(출처 : 요약 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3 1. 연구배경 ... 3 2. 연구최종목표 ... 4 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 4Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 5 1. 재 료 ... 5 2. 연구전략 및 방법 ... 5Ⅲ. 연구결과 ... 6 1. 제1세부과제: 가금시료별 metagenomics 기법 확립 ... 6 2. 제2세부과제명 : 전염성 선위염 및 흡수불량증후군 원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용 ... 13 3. 제3세부과제 : 야생조류 조종별 결장조직내 세균 및 바이러스의 군집 분석 및 새로운 조류 원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용 ... 22Ⅳ. 연구결과요약 ... 39 1. 제1세부과제인 가금시료별 metagenomics 적용 기법 확립을 위해 분변 시료에서 바이러스 입자 농축 등 전처리방법을 비교 실험 ... 39 2. 제2세부과제인 전염성 선위염 및 흡수불량증후군 원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용 ... 40 3. 제3세부과제인 야생조류 조종별 결장조직내 세균 및 바이러스의 군집분석 및 새로 조류원인체 동정을 위한 metagenomics 기법 적용 ... 40Ⅴ. 고 찰 ... 41Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 43Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 43Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 44IX. 참고자료 ... 44끝페이지 ... 45