[보고서]이질적 암세포 표류에 관여하는 면역회피와 면역관용 현상 연구

김문교

이질적 암세포 표류에 관여하는 면역회피와 면역관용 현상 연구
Studies on the immune escape and tolerance during heterogenous cancer cell drift 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	인하대학교 InHa University
연구책임자	김문교
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-03
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO202100000639
과제고유번호	1711092083
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2021-06-05
키워드	암세포 이질성.암 세포 표류.암진행과 전이.암면역상.암면역회피.면역관용.형광단백질.세포추적.PRSS14.

초록 ▼

○ 연구개요
암의 진행과 전이성 획득, 치료제에 대한 저항의 기저가 되는 암세포의 이질성을 연구하였다.
이질성(Heterogeneous) 암세포의 표류(Drift)에 미치는 암면역회피(Immune escape) 현상과 면역관용(Immune Tolerance) 기전을 연구하였다
암특이 자가항원으로 막단백질 분해효소 Prss14를 발현하는 암세포를 이식하여 암세포 이질성 표류상황을 추적하였다
세포집단의 분석과 유전자 프로파일링을 통하여 암 면역회피와 암 면역관용을 연구하였다
암면역회피와 암면역관용에 따른 암세포 이질화 과정에서 Prss14의 기여도를 확인하였다
이질적 암세포표류에 관여하는 면역회피와 면역관용의 시스템 네트워크 모델을 수립하였다

○ 연구 목표대비 연구결과
EGFP 표지 이질적 피부암세포 B16의 표류에 미치는 면역회피와 면역 관용의 추적: (1년차)
* C57BL/6생쥐와 T세포면역관용 모델(3.1T-EGFP)와 EGFP를 항원제시세포에서 발현(Get40) 이질성을 가진 형광 세포주를 이식후 암형성과 전이 과정에서의 면역 제어, 평형과 회피 추적
* 암진행의 시간적 변화 모니터링, 전이상 검증; 형광단백질 발현 암세포와 면역세포 추적
이질적 암세포 표류와 면역반응과정에서 Prss14의 역할 (1-3년차)
PRSS14 발현 E0771세포주의 이질성특성 연구: 유세포 분석법을 이용한 집단 분석
* PRSS14 단백질(shedding형, active 형, EICD형 등)에 따른 세포변이 관계 확인
* PRSS14 단백질 knock down 세포 이용 세포 이질화 표류 검증
* RNAseq을 이용한 암세포 이질 집단 유전자 표류 현상 추적
생쥐 내 암세포 이질화와 PRSS14 역할 연구
* 암세포 이식 orthotopic 모델에서의 이질화 표류 추적
* RNAseq을 이용 생쥐모델에서 Prss14에 따른 암세포 이질화 유전자 표류현상 추적
유방암세포 이질화에 미치는 면역회피와 면역관용 연구
* E0771의 면역회피성 면역세포 기전 연구
이질성에 따른 암세포간 경쟁과 면역상의 역할 네트워크 모델 수립 (2-3년차)
RNAseq을 이용한 유전자 발현 프로파일 데이터의 바이오인포마틱스적 분석
* 암세포 발현 유전자 차이와 생쥐 면역성 차이의 관계성
* 암세포 이질 집단의 유전자 발현 양상에 미치는 Prss14의 기능 네트워크 수립
암진행과 전이에서 암세포 이질화 유래 유전자와 면역상의 관계 네트워크모델 수립.

○ 연구개발결과의 중요성
* 본 연구는 암조직을 하나의 단위로 보지 않고 암세포의 이질성을 in vivo에서 세포단위로 분석하는 선도적 연구로 암전이백신의 개념을 수립하고 동물실험을 통해 확인하였다
* 암세포집단이 유방암 모델 생쥐에서 in vivo 이질성의 중요성과 면역상을 연구하였다.
* Prss14의 단백질이 암세포 이질성에 관여하는 기전을 최초로 규명하였다.
* 새로운 현상의 발견과 이미 존재하는 빅데이터를 합하여 다차원적인 암진행 전이 네트워크를 수립하여 암치료 복합제제를 찾아 암 정복을 목표로 삼는 창조적 연구를 진행하였다
* Prss14의 활성화루프 구조를 에피톱으로 하여 암전이 백신의 개녕을 수립하고 효능을 검증하였다
* Prss14의 활성화루프를 이용한 전이백신 모델에서 일어나는 생쥐면역상을 연구하고 호스트면역상이 미치는 백신효과를 검증하였다.
* 본 과제를 통하여 석박사 학생을 훈련하여 사회진출에 성공하였다.
* 본 과제를 신약개발지원센타의 도움으로 신약으로서의 제품화과정에 도전하였다.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
(1). 연구개발의 목표 ... 4
(2). 연구개발의 년차별 구체적 수행내용 요약 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
3. 연구개발결과의 중요성 ... 16
4. 참고문헌 ... 16
5. 연구성과 ... 17
대표적 연구실적 ... 19
끝페이지 ... 27

표/그림 (15)

표 Mouse and cell line model used in this study. (A) Three mouse models used in this study. (B) Flow cytometric plotsshow I-Ab and EGFP expression of CD11c+CD8a+ cells fromspleen of Get40 mouse. (C) B16-EGFP melanoma tumor cell line before and afterEGFP high expressing sorting by Flow cytometry. (D) Images of sorted B16-EGFPcells under bright, green, and red fields. Pseudocolored in Adobe PhotoshopCS6
표 Immunological response to EGFP+tumor in 3 mouse models. (A) Tumor growth in B6, 3.1T-EGFP, and Get40 miceinoculated with B16-EGFP melanoma. (B) Tumor size at 10, 13, 15, 17, 19, and 21days after injection in three mouse models. (C) Proportion of GFP+to CD45- in tumor. *p=0.0390; ***p=0.0001; unpaired t-test. (D)Tumor size normalized with proportion of GFP+ in tumor. Filled barindicates GFP+ population of tumor and blank bar represents the restof tumor. And dotted line and solid line indicate the mean of GFP+population and the rest of tumor respectively. (E) Representative images of the expression of GFP and G8.8 (EpCAM) on CD45- cells from B16-EGFP cell line andtumors of 3 mouse models. The polygon represents GFP+ population in tumors. (F)Correlation between tumor weight and proportion of B220+ to CD45+in tumors. (G) Correlation proportion of Thy1.2+ to CD45+in tumors with tumor weight. The R2 and P value are indicated oneach graph
표 B16-EGFP tumor growth after immunizationof his-tagging EGFP in 3 mouse models. (A) The experimental scheme of Immunization of his-tagging EGFP (hisEGFP) in 3 mouse models. 3 mouse models were subcutaneously immunized with 20ug of hisEGFP andadjuvant MF59 four times at intervals of two weeks. 3 days after 4th hisEGFPinjection, these mice were inoculated with 2x105 cells of B16-EGFP. (B) Tumor growth of B16-EGFP afterfour times of hisEGFP immunization. Solid lines indicate hisEGFP-immunized miceand dotted lines indicate non-immunized mice. (C) Tumor growth at 8, 12, 15, and 17 days after injection in eachmouse models. (D) Analysis of EGFP specific TH type. The dilution rate of the sera was 1:30.Filled and blank dots each indicate immunized mice and non-immunized mice
표 B cell and T cellresponses in hisEGFP-immunized 3 mouse models. Proportion of B220+cells (A), Thy1.2+cells (B), CD8+Tcells (D) to CD45+cells from spleen. Filled dots indicate immunized mice and blank dots indicatenon-immunized mice. All samples were gated with CD45+DAPI-.*p=0.0319; *p=0.0410; **p=0.0054; unpaired t-test. (C) and (E) Shown are representative plots with B220, Thy1.2, CD4,and CD8 expressions
표 Macrophageresponses in hisEGFP-immunized 3 mouse models. (A) Proportion of CD45+cells. *p=0.0489; unpaired t-test. (B)and (C) Proportion of ratio oftumor infiltrating cells (RIC; Gr-1+CD11b+, Gr-1-CD11b+).(D) Correlation of ratio oftumor infiltrating Gr-1-CD11b+ cells with tumor weight.The R2 and P value are indicated on each graphs. (E) Representative plots of Gr-1 andCD11b expression on CD45+DAPI- cells are shown
표 Cell Scattering and Morphological Drift of 4T1Cells during Culture in Three Media Types (A) Phase contrast images after 6-week culture of 4T1 ineach media RPMI1640, IMDM and DMEM. In 4T1 of IMDM, loss of cell-cell contactis noticeable point found in entire cell culture. On the other hand, 4T1 ofRPMI1640 and 4T1 of DMEM maintained the morphology of original 4T1(data notshown). Picture of upper panels are phase contrast images of 4T1. Middle panelsare 4T1 cells which are stained with phalloidin for actin (red) and DAPI fornucleus (blue). Lower panels are inverted images of actin and nucleus stain.Scale bar = 50μm. (B) Phase contrast images after 6-week culture of4T1-EpiKD in three different media. Scale bar = 50μm
표 Variation of Transwell Migration upon MediaComponent and Epithin/PRSS14 Shedding (A and B) Transwell migration assay of 4T1, 4T1-Ctl and4T1-EpiKD cells that are grown in RPMI1640, IMDM or DMEM with or without TGFβ after two-day incubation. Hematoxylin stained migrated cells wereobserved significantly in 4T1 of IMDM than other media, and TGFβ treated control than negative. 4T1 cells with dashed box were enlargedbelow to compare scattering by TGFβ. Quantified migration through threedifferent fields with duplicates was calculated as a graph in B. Data arepresented as mean ± SEM. Statistical significance was performed between twodifferent media. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001;, **** p<0.0001(Student’s t-test)
표 Drifts in Heterogeneity of 4T1 Cells uponCulture Media and Epithin/PRSS14 Expression (A) 4T1 and 4T1-EpiKD cell lines grown in threemedia were analyzed with flow cytometry to uncover population of cancer stemcell. Sca1 and Syndecan1 were stained with PE-Cy7 and PE individually
표 Epithin/PRSS14 deficient orthotopic tumormaintained decreased SCA1 but survival behavior remains incomprehensive (A) Schematic illustration of orthotopic tumor model of Band C. 1x10^5 cells were injected into mammary fat pad of Balb/C mice. (B and C) Representative flow cytometry results ofprimary tumors from orthotopic implantation with 4T1 or 4T1-EpiKD grown in DMEMare shown in B. Sca1 positive population is more abundant in epithin/PRSS14positive tumor originated from 4T1 than that from 4T1-EpiKD. (C) Average Sca1 positive populations from totalorthotopic tumors. Data are presented as mean ± SEM (n=3~4). **** p<0.0001(Student’s t-test). (D and E) Schematic illustration of tail vein injectionmodel in D. Survival analysis was performed with Balb/C mice which wereinjected with 5x10^5 of 4T1 or 4T1-EpiKD cells through tail vein and thepercent survival was presented in E (n=6~7). Mice injected with D-4T1-EpiKDshows enhanced survival than those with D-4T1. However, mice with I-4T1-EpiKDor R-4T1-EpiKD injection showed reduced survivals. Survival rate was comparedby Log-rank (Mantel-Cox) test. ** p<0.01; *** p<0.001
표 Epithin/PRSS14 Dependent Genetic Heterogeneityof 4T1 cells with Transcriptome Analysis (A) Correlation matrix with FPKM value of all transcriptsbetween every combination. Each 4T1 shows no correlation even though they comefrom same origin. Numbers with color represents Pearson’s coefficient. (B) MA plot of differentially expressed genes foundbetween I-4T1 and D-4T1 or D-4T1 and D-EpiKD. Each dot represents one gene andcolor coded according to its p-value. Ns, grey; p<0.05, yellow; p<0.01,orange; p<0.001, red; p<0.0001, purple. (C) Heatmap of EMT signature genes expresseddifferentially. Genes - Ccl2, Mmp9 and S100a4 – withpattern which is the highest in I-4T1 or D-EpiKD are marked with asterisk (*)
표 Clinical Implication of Epithin/PRSS14Expression with Macrod1 (A) RNA expression level of PRSS14 (ST14) and Macrod1.Macrod1 is a candidate gene involved in DNA repair, showed decreasedpattern in epithin/PRSS14 deficient 4T1 grown in DMEM (D-EpiKD). (B) Survival analysis of TCGA patients with breastcancer. The survival of patients who express both PRSS14 and Macrod1highly shows decreased percent than that of patients who have low PRSS14and low Macrod1 expression. The significance was statistically estimatedby Log-rank (Mantel-Cox) test. * p<0.05
표 Polarizing influences of loop metavaccinationwith CFA or alum on tumor growth and lung metastasis in PyMT mice. (A) Average tumor growth curves were based on bi-weeklymeasurements. Unimmunized vs. CFA-loop; *p = 0.0115.(B) Primary tumor weights. **p = 0.0064, *p = 0.0110. (C) Metastasis nodules.Left: CFA, Right: alum. **p = 0.0044, *p = 0.0225. (D) Representative images ofmetastasis nodules. (E) Correlation analysis of primary tumor weights andmetastasis nodules. CFA-loop: filled square, CFA-Sc: open square, alum-loop:filled round, alum-Sc: open round. (F) ELISA of anti-loop antibody production inPyMT mice. Black: 1:1000, Grey: 1:3000, White: 1:9000 dilution. (G) Correlationanalysis of tumor weights (Left) and to metastasis nodule numbers (Right).CFA-loop: filled square, alum-loop: filled round. (H) Isotype analysis of theanti-loop antibodies by ELISA.CFA-loop: filled square, alum-loop: empty round
표 Expression profile analyses of immune cells andeosinophil chemoattractants. (A) Heatmapof selected signature genes and transcription factors for lymphoid cells alongwith Prss14 and its inhibitors. (B) Heatmap of selected signature genes formyeloid cells. (C) Heatmap analysis of eosinophil chemoattractants (Top). Hierarchicalclustering of eosinophil chemoattractant gene profiles (Bottom). Color key:-2.0 (green) to 2.0 (red). Group names at the bottom
표 Survival plots of TCGA-BRCA patients with eosinophilsignatures and ST14 expression. SIGLEC-8, CCL4, CCL11, CCL24, and CCL26 RNA expression profiles ofbreast cancer patients (n = 80) were collected from TCGA. (A) Survival curve oftotal breast cancer patients by eosinophil gene expression levels. Highexpression: solid line, low expression: dotted line. SIGLEC8high vs. SIGLEC8low; *p = 0.0270, CCL4highvs. CCL4low; *p = 0.0178, CCL24high vs. CCL24low;*p = 0.0146. (B) Survivals of patients with eosinophilgene expression in ST14high patients. ST14highCCL4high vs. ST14highCCL4low; *p = 0.0172, ST14highCCL24high vs. ST14highCCL24low; *p = 0.0372. (C) Survival of ER- patientswith eosinophil gene expression in ST14high patients (n = 27). ER-ST14highCCL4high vs. ER-ST14highCCL4low; *p = 0.0332. ST14higheosinophil genehigh: solid black line,ST14high and eosinophil genelow: dotted black line, ST14lowand eosinophil genehigh: solid gray line, ST14low andeosinophil genelow: dotted gray line
표 Model ofimmunological influences involved in the effects of loop metavaccineimmunization against breast cancer

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