[보고서]편도유래 줄기세포에서 근골격계 재생을 위한 세포 분화기술 확립 및 유효성 분석

조인호

보고서 정보

주관연구기관

이화여자대학교
Ewha Womans University

연구책임자

조인호

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-10

과제시작연도

2019

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202100002086

과제고유번호

1711082311

사업명

바이오.의료기술개발(R&D)

DB 구축일자

2021-06-12

키워드

편도유래줄기세포.분화.골세포.근육재생.골다공증.

표 연구개발 개요
표 편도에서 분리 및 확보된 세포의 MSC로써의 특성을 조사. A. MSC의 positive (CD73, CD90, CD105)와 negative (CD14, CD34, CD45) 발현 확인. B. TMSC의 골, 연골, 그리고 지방분화로의 특징 확인
표 편도줄기세포의 근육세포로의 분화과정
표 분화된 근육세포의 conditioned medium (CM)을 모아 Cytokine Array로 분석 결과. T-MSC, tonsil-derived mesenchymal stem cell; GM, growth medium; MYOCYTE, T-MSC-derived myocyte; DM, differentiation medium; 1W, 1 weeks after myogenic differentiation; 2W, 2 weeks after myogenic differentiation
표 편도줄기세포 유래 근육세포에서 분비가 증가된 cytokine의 세포내 유전자 발현. 그림의 caption은 그림 8과 같음
표 T-MSC를 PTH 분비세포로의 분화를 위한 실험 디자인
표 TMSC를 각각 100 ng/mL의 Activin A와 Shh로 PTH 분비세포로 7일 동안 분화시킨 후 (A) Immunofluorescence (GFP: PTH, Dappi: Nucleus) (B) 분화 후 High (1.5 mM), Normal (0.9 mM), or Low (0.5 mM)의 외부 칼슘농도를 가진 미분화 배양액에서 7일 그리고 14일 동안 연이어 배양한 후 Western blotting을 통한 PTH 단백질 발현양 측정 결과
표 T-MSC를 부갑상선 호르몬 분비세포로 분화시키기 위한 Activin A와 Shh의 농도 조절양
표 TMSC를 Activin A와 Shh의 농도를 달리하여, PTH 분비세포로 7일간 분화시킨 뒤 PTH 단백질 발현양 확인 결과
표 PTH를 100 ng/mL (1), 50 ng/mL (1/2), 10 ng/mL (1/10), or 2 ng/mL (1/50)의 Activin A와 100 ng/mL의 Shh를 배양액에 첨가하여 PTH 분비세포로 7일간 분화한 뒤 단백질 발현양 조사 결과. (A) PTH, (B) CHGA
표 TMSC를 각각 100 ng/mL의 Activin A와 Shh를 첨가한 조건이외 다양한 배양조건에서의 PTH 분비세포로 7일간 분화 후, 연이어 2주 더 배양 후의 단백질 발현양 측정 결과. (A) PTH, (B) CHGA, (C) CaSR
표 TMSC를 High or Low Glucose가 함유된 DMEM에서 Activin A의 농도를 달리하여 7일 동안 분화시킨 뒤 PTH 단백질을 발현양 측정 결과
표 Microarray를 통한 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포의 분화배양액 별 특성 탐색. A. D7 vs C7, B. D14 vs C14. 그림의 caption은 그림 12와 같음
표 펩타이드의 골분화 촉진효과의 연구 디자인
표 TMSC를 각각 100 μM 펩타이드를 처리하여 14일 동안 분화시킨 후 결과. (A) ALP activity and (B) Alizarin Red S. when differentiation started at 100% confluency, (C) Alizarin Red S. when differentiation started at 50~70% confluency
표 TMSC를 세부과제 1에서 추천된 농도로 펩타이드를 처리하여 14일 동안 분화시킨 후 칼슘 침착도 결과
표 TMSC를 다양한 농도의 펩타이드를 처리하여 14일 동안 분화시킨 후, 칼슘 침착도를 대조군과 비교한 결과 (Error bar는 +/- standard error bar로 표기함)
표 다른 donor로부터 분리한 TMSC를 선택된 농도의 펩타이드를 골분화 14일 동안 넣어줌으로서 골분화 촉진의 유효성을 Alizarin Red S를 사용한 칼슘 침착도로 평가
표 (A) 펩타이드 4를 TMSC에 농도별 (10 uM~1 pM)처리하여, 골분화를 촉진시킨 후, 칼슘 침착도를 대조군과 비교한 결과. (Error bar는 +/- standard error bar로 표기) (B) 100 pM의 펩타이드 4로 TMSC의 골분화를 14일 동안 촉진시킨 후 칼슘 침착도와 ALP activity를 대조군 비교한 결과
표 TMSC를 사용하여, 펩타이드 4의 골분화에 대한 유도/촉진 효과 조사
표 펩타이드 1과 4가 osteogenesis의 분화마커인, osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN), Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), 그리고 alkaline phosphatase (ALP)의 단백질 발현양에 끼치는 영향조사
표 nanosurface 배양접시에서 분화된 TMSC-myocyte의 펩타이드 첨가 효과
표 분화기간 연장에 따른 T-MSC-myocyte의 세포융합비율의 증가
표 TMSC-myocyte의 기능성 골격근세포로의 분화능의 확인 (A) Real-time PCR을 이용한 AchR 유전자의 발현 증가를 확인 (B) Western blotting을 이용한 AchR와 GLUT4단백질의 발현 증가를 확인 (C) 면역형광염색을 통한 AchR단백질의 세포 내 발현 학인
표 PAX7의 발현을 통한 줄기세포의 근육세포로의 잠재성 확인 (A) TMSC: 미분화 세포에서 발현하다가 분화 후 발현이 소멸 됨 (B) AdMSC: 분화 전/후 세포에서 모두 발현율이 매우 낮거나 비특이적 발현을 나타냄. Pax7, paired box protein 7
표 편도유래줄기세포와 지방줄기세포의 골격근세포로의 분화능 비교. Dystrophin, MHC, α-SMA: 근육세포 마커. α-Actinin, Myogenin: 골격근세포 특이적 마커. 편도유래줄기세포유래 골격근세포, TMSC-myocyte; 지방줄기세포유래 골격근세포, AdMSC-myocyte; : Pax7, paired box protein 7; MHC, myosin heavy chain; α-smooth muscle actin, α-SMA
표 골지지체에 혼입하기 전 편도 줄기세포의 선 배양 조건에 따른 골형성 ALP 측정결과. Undifferentiation, undifferentiated TMSC; Differentiation (D-3, D-5, D-7), differentiated TMSC for 3, 5, 7 days, respectively, prior to embedding to polycarpolactone (PCL); ALP, alkaline phosphatase
표 골지지체에 혼입하기 전 편도 줄기세포의 선 배양 조건에 따른 골형성 칼슘침착 결과. Undifferentiation, undifferentiated TMSC embedded in PLC; Differentiation (D-day), embedded as undifferentiated TMSC then differentiated for 3 or 7 days in PLC; Differentiation (D+3), undifferentiated TMSC in PLC for 3 days then differentiated for next 3 or 7 days; Differentiation (D-3), differentiated TMSC for 3 days prior to embedding to PCL then further differentiated in PLC for next 3 or 7 days
표 골지지체에 혼입하기 전 편도 줄기세포의 선 배양 조건에 따른 골형성 유전자 발현 분석결과. 그림의 caption은 그림 4와 같음
표 1×106의 TMSC를 HA:DMEM의 비율을 1:1 (total 200uL) 그리고 1:2 (total 300 uL)로 혼합하여 (A) 세포와 HA의 혼합력을 현미경으로 관찰한 결과. (B) 파이펫팁과 주사기로 배출 뒤의 형태를 조사한 결과
표 HA:DMEM의 비율을 1:1 그리고 1:2비율로 섞은 혼합물을 쥐의 피하에 주사한 뒤, 다음날 쥐의 피하에 주사된 혼합물을 빼내어 형태와 보존도를 관찰한 결과
표 TMSC의 PTH 분비 세포로의 분화과정
표 분화된 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포 A. 유전자 및 B. 단백질 발현 분석결과. C7 D7 PTH, parathyroid hormone; CHGA, chromogranin A; CASR, calcium-sensing receptor; CLSTN2, calsytenin-2; HK2, human proximal renal tubular epithelial cells
표 편도줄기세포 유래 부갑상선분비세포의 유효성 평가. C7과 D7실험군의 세포를 저농도(L)와 고농도(H)의 칼슘(Ca2+)에 노출시켜 부갑상선분비 조절이 가능한지 확인. C0, 0 days after culture with growth medium; C7 D7 D7 CHGA, chromogranin A; CASR, calcium-sensing receptor; HK2, human proximal renal tubular epithelial cells; h_P, human parathyroid adenoma
표 근육세포 분화 중 세포 배양액 내의 엑소좀 분리 및 엑소좀 내 miRNA 스크리닝
표 마이크로어레이 분석 전, 엑소좀 추출에 사용된 세포들. 화살표: myotube형태, 다핵세포를 가리킴
표 마이크로어레이를 통한 TMSC-myocyte의 CM으로부터 추출한 엑소좀의 miRNA 스크리닝. 분화가 진행됨에 따라 발현이 증가(A)하거나 감소(B) 하는 유전자의 heat map과 그래프
표 근육으로의 분화가 진행됨에 따라 발현이 증가하는 miRNA의 근육관련 카테고리 별 선별
표 대퇴부의 Micro-CT 촬영 결과
표 발암성에 관련된 유전자지표들 (Tan and Yeoh, 2015 Gastroenterology 149(5): 1153-62)
표 A. 난소절제술(OVX) 의 시행과정과 B. OVX-mice의 3달동안의 몸무게 변화. (각 그룹당 n=10)
표 Micro-CT 분석을 이용한 골재생 효과 판정방법
표 Normal 그리고 OVX-mice의 대퇴골 bone mass density (BMD), bone volume (BV)/ total volume (TV)를 측정한 결과. (각 그룹당 n=10)
표 골다공증동물 모델을 사용한 TMSC의 작용기전 연구맵
표 분화 그리고 미분화된 TMSC 주사를 경골 근위부로 직접 투여 받은 쥐군들의 첫 투여 3개월 후 혈청 OCN과 ALP농도. (n=10 for normal, no treatment, rhPTH groups; n=5 for TMSC groups.)
표 분화 그리고 미분화된 TMSC injection를 경골 근위부로 직접 투여받은 쥐군들의 첫 투여 3개월 후 혈청 칼슘과 인의 농도. (n=10 for normal, no treatment, rhPTH groups; n=5 for TMSC groups.)
표 양성대조군 그리고 T-MSC의 주사를 받은 실험군들의 대퇴골 Micro-CT결과
표 양성대조군 그리고 T-MSC의 주사를 받은 실험군들의 대퇴골의 BMD와 BV/TV
표 골질환에 관련된 6개 나라의 통계자료 (IOF)

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