초록 ▼

단백질 실시간 모니터링 및 상호작용 탐색 시스템 확립
- 세포내 형광 부착용 비천연 아미노산을 단백질에 첨가 시키기 위해 형광 부착용 비천연 아미노산을 선별 하고 유기합성 하여 HPLC 및 LS-MS로 분리 확인하였음.
- 형광 부착용 비천연 아미노산을 동물세포 내 단백질에 첨가하기위한 플라스미드를 제작하였고 이는 pCDNA3 Vector를 사용하였으며 EF1A promter와 CMV enhancer 및 U6 promoter하여 발현을 조절하였음.
- 단백질 상호작용 탐색 시스템을 구축하기 위해 상호작용 비천연 아미

단백질 실시간 모니터링 및 상호작용 탐색 시스템 확립
- 세포내 형광 부착용 비천연 아미노산을 단백질에 첨가 시키기 위해 형광 부착용 비천연 아미노산을 선별 하고 유기합성 하여 HPLC 및 LS-MS로 분리 확인하였음.
- 형광 부착용 비천연 아미노산을 동물세포 내 단백질에 첨가하기위한 플라스미드를 제작하였고 이는 pCDNA3 Vector를 사용하였으며 EF1A promter와 CMV enhancer 및 U6 promoter하여 발현을 조절하였음.
- 단백질 상호작용 탐색 시스템을 구축하기 위해 상호작용 비천연 아미노산 4 종을 선별하고 유기합성 하여 NMR과 LC-MS로 그 결과를 확인하였음
- 상호작용 비천연 아미노산을 인식하는 AARS/tRNA를 찾기 위해 Vector construct 를 구축하고 무작위적 돌연변이를 디자인하고 selection 시스템을 통해 돌연변이 AARS를 탐색하고 있음.

(출처 : 보고서 요약서 3p)

Abstract ▼

The purpose of this study is to establish protein monitoring system in live animal cells via incorporation of specific unnatural amino acid(s) into designated position of target proteins and subsequent labeling of fluorescent dye through chemical crosslinking with the unnatural amino acid. Another p

The purpose of this study is to establish protein monitoring system in live animal cells via incorporation of specific unnatural amino acid(s) into designated position of target proteins and subsequent labeling of fluorescent dye through chemical crosslinking with the unnatural amino acid. Another purpose of this study is to develop protein-protein interaction detection system via incorporation of specifically designed unnatural amino acid(s) and following chemical or photo-activation of the functional group of the unnatural amino acid for covalent bond formation with neighboring or interacting protein molecules.

For development of protein monitoring system in live cells, fluorescent dye-attachable unnatural amino acid, TCO-Lys was selected and synthesized. The synthesized product was confirmed by HPLC and LC-MS analysis. To establish site-specific incorporation system of TCO-Lys, the amino acid binding pocket of M. mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase was mutated by site-directed mutagenesis.

Next, to develop protein-protein interaction detection system, four covalent bond-inducing unnatural amino acids were selected and synthesized. The synthesized product was verified by NMR and LC-MS analysis. To find AARS/tRNA pair recognizing each unnatural amino acid, evolution of AARS was conducted based on IdbKRS, IdFRS, and OmeRS, which have similar molecular structure with AzbK, DhbK, and AzF. IdbKRS recognizing AzbK and DhbK is being evolved by directed evolution of AARS using positive and negative selections. AzFRS is being evolved from IdFRS and OmeRS by selection system.

Our next step to move on is to search the best condition for incorporating each unnatural amino acid into target proteins. By attaching fluorescent dye in model protein, we expect monitoring of target protein in live cells can be viable. Also, we plan to screen protein-protein interaction of target protein via optimizing covalent bond formation of incorporated unnatural amino acids.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• S U M M A R Y ... 5
• C O N T E N T S ... 6
• 목차 ... 7
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 8
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 9
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 10
• 1 절 단백질 모니터링을 위한 비천연 아미노산 첨가 단백질 생산 ... 10
• 1. 형광부착용 비천연 아미노산 1종 선별 및 유기합성 ... 10
• 2. TCO-lys의 단백질 위치 특이적 첨가 시스템 확립 ... 13
• 2절 단백질 상호작용 탐색 시스템 확립 ... 14
• 1. 공유결합 유발 비천연 아미노산의 선별 및 유기합성 ... 14
• 2. 단백질 상호작용 비천연 아미노산 인식하는 AARS/tRNA 디자인 및 선별 ... 21
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 24
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 25
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 26
• 제 7 장 참고문헌 ... 27
• 끝페이지 ... 28