초록 ▼

- LKB1은 폐암의 20~30%에서 돌연변이 되는 종양억제 유전자로서 그 하위 경로로 발굴한 CYP24A1-비타민D 및 KYNU-q비타민B3 경로의 조절 기전 및 대사변화를 규명하여 새로운 항암전략을 수립하고자 함.

- 기전연구 및 항암효능 실험을 위해 폐암 세포주에서 CYP24A1 및 KYNU 발현 억제 유도 및 과발현 시스템과 CYP24A1, VDR, KYNU 전사활성 및 비타민 D 반응성(VDRE)을 측정하는 luciferase assay 시스템을 확립하였음.

- LKB1 돌연변이에 의한 CYP24A

- LKB1은 폐암의 20~30%에서 돌연변이 되는 종양억제 유전자로서 그 하위 경로로 발굴한 CYP24A1-비타민D 및 KYNU-q비타민B3 경로의 조절 기전 및 대사변화를 규명하여 새로운 항암전략을 수립하고자 함.

- 기전연구 및 항암효능 실험을 위해 폐암 세포주에서 CYP24A1 및 KYNU 발현 억제 유도 및 과발현 시스템과 CYP24A1, VDR, KYNU 전사활성 및 비타민 D 반응성(VDRE)을 측정하는 luciferase assay 시스템을 확립하였음.

- LKB1 돌연변이에 의한 CYP24A1 및 KYNU 과발현은 mRNA 수준에서 증가하였지만 luciferase assay에서 전사활성은 증가하지 않았고, mRNA 안정성이 증가한 것으로 확인되었음. 또한 LKB1 하위 경로에서 CYP24A1 발현은 AMPK 의존적이지만 mTORC 비의존적이었고, KYNU 발현은 AMPK-mTORC1 모두 비의존적으로 조절됨을 확인하였음.

- KYNU 발현 억제 및 과발현 모두 암세포 성장에 뚜렷한 차이를 나타내지 않았음. 또한 KYNU 발현억제와 병용으로 CYP24A1 발현 억제 및 NRF2 억제를 함께 시도하였지만 뚜렷한 시너지 효과가 나타나지 않았음. 하지만 KYNU 발현 억제시 NADPH 대사에 유의적인 변화가 관찰되어 비타민B3 대사에 영향을 주는 것으로 판단됨.

- LKB1 돌연변이에 의한 비타민D에 대한 저항성은 LKB1-WT 재발현 또는 CYP24A1 발현 억제와 함께 VDR을 과발현시킨 경우 비로소 비타민D에 대한 반응성과 함께 항암효과가 크게 증가함을 확인하였음.

- LKB1 돌연변이 폐암 세포인 A549에서 비타민D 반응성 및 항암효과를 높이는 약물을 발굴하기 위해 임상화합물 라이브러리를 이용한 신약재창출 스크리닝을 통해 FBX, NTX 가 단독으로도 비타민D 활성을 증가시킴을 발견되었으며, HDAC inhibitor 인 TSA, VOR 은 비타민D 의 반응성을 크게 증가시킴을 발견하였음. TSA, VOR 약물에 의한 비타민 D 반응성 증가는 VDR 발현 증가에 기인하였음.

- LKB1-AMPK 경로는 해당과정 조절로 젖산(lactic acid)의 생성, 특히 acid (산) 의 생성을 감소시켜 CYP24A1 및 VDR 발현을 감소시켰음. 흥미롭게도 LKB1 발현 및 저포도당 배지에 의해 감소된 CYP24A1, VDR 발현은 염산 처리에 의해 회복되었음.

- 염산의 작용 기전으로 리소좀 내 칼슘의 증가 및 산성화를 통한 리소좀의 활성화인 것으로 제시하였으며 그 이유로는 1) v-ATPase 억제제인 BFA를 처리하여 리소좀의 산성화를 억제한 상태에서 이들 발현이 억제됨을 확인하였고, 2) 세포질의 칼슘을 고갈시키는 BAPTA-AM 처리는 염산에 의한 이들 발현의 증가를 억제하지 못하였으며 3) 소포체와 리소좀의 칼슘 고갈을 유도하는 TG/TM을 처리한 경우 CYP24A1, VDR 발현이 감소되었으며 이는 염산에 의해서도 회복되지 못하였음. 또한 4) 산성에 의해 활성화 되는 소포체에 존재하는 칼슘 채널인 TRPV4 활성화 약물인 GSK101에 의해 CYP24A1, VDR 발현이 증가되었고, 저포도당에 의해 감소된 이들 발현을 완전히 회복시켰음.

- 즉 염산은 소포체에 존재하는 칼슘채널인 TRPV4를 활성화 시켜 소포체내 칼슘의 리소좀 내로의 이동을 촉진시키고, v-ATPase를 통해 직접 리소좀 내로 들어가 리소좀 내의 산성화를 촉진시켜 리소좀의 활성화를 유도해 CYP24A1, VDR 발현을 증가시킨 것으로 판단됨.

- 마지막으로 리소좀의 활성화는 전사인자인 TFEB, TFE3 을 활성화 시키는 것으로 알려져 있으며, 실제로 이들의 발현을 억제시킨 경우 CYP24A1, VDR 발현이 각각 감소하는 것으로 발견하여, LKB1-AMPK-glycolysis-H⁺-Ca²⁺-TFEB/TFE3-CYP24A1/VDR-비타민 D 신호전달 경로의 가능성을 제시하였음.

(출처 : 요약문 5p)

Abstract ▼

- LKB1 is a tumor suppressor gene that is mutated in 20-30% of lung cancers and the aim of this study is to establish a new anticancer strategy by elucidating the regulatory mechanisms and metabolic changes of the CYP24A1-vitamin D and KYNU-q vitamin B3 pathways identified as the new downstream targ

- LKB1 is a tumor suppressor gene that is mutated in 20-30% of lung cancers and the aim of this study is to establish a new anticancer strategy by elucidating the regulatory mechanisms and metabolic changes of the CYP24A1-vitamin D and KYNU-q vitamin B3 pathways identified as the new downstream target of lkb1 pathway.

- For the study of mechanism and anti-cancer efficacy, we established a system for inducible knockdown and overexpression systems for CYP24A1 and KYNU genes in lung cancer cell lines and luciferase assay system for measuring CYP24A1, VDR, KYNU transcriptional activity and vitamin D receptor activity (VDRE).

- Overexpression of CYP24A1 and KYNU by LKB1 mutation increased in mRNA level but did not increase transcriptional activity in luciferase assay but mRNA stability was increased. In addition, it was confirmed that CYP24A1 expression was AMPK-dependent but mTORC-independent in the LKB1 downstream pathway, and KYNU expression was regulated independently of AMPK-mTORC1 pathway.

- Either inhibition of expression or overexpression of KYNU did not show any significant differences in cancer cell growth. In addition, we tried to inhibit the expression of CYP24A1 and NRF2 in combination with the inhibition of KYNU expression but did not show a clear synergistic effect. However, a significant change in NADPH metabolism was observed when KYNU expression was inhibited, which may affect vitamin B3 metabolism.

- The resistance to vitamin D by LKB1 mutation was reversed to be sensitve to effect of vitamin D on vitamin D response and colony growth only when VDR was overexpressed with LKB1-WT reexpression or inhibition of CYP24A1 expression.

- During a clinical compound library screening to identify a drugs that enhance vitamin D reactivity in A549, a mutant LKB1 mutant lung cancer cell, FBX and NTX were found to increase vitamin D activity. HDAC inhibitors TSA and VOR were found to significantly increase the effect of vitamin D. Increased vitamin D effect by TSA and VOR was due to increased VDR expression.

- The LKB1-AMPK pathway reduced CYP24A1 and VDR expression by reducing the production of lactic acid, in particular acid, by regulating aerobic glycolysis. Interestingly, CYP24A1, VDR expression reduced by LKB1 and low glucose medium was recovered by hydrochloric acid treatment.

- The mechanism of action of hydrochloric acid is suggested to be the activation of lysosomes by increasing calcium and acidification in lysosomes based on these data: 1) BFA, a v-ATPase inhibitor, which inhibit acidification of lysosome, inhibited the expression of CYP24A1. 2) BAPTA-AM treatment, which depletes cytosolic calcium, did not prevent the increase of CYP24A1 expression by hydrochloric acid, 3) TG and TM which cause calcium depletion in ER and lysosome reduced the expression and was not recovered by hydrochloric acid, 4) the expression of CYP24A1 and VDR was increased by GSK101 which activate TRPV4, an acid-activated calcium channel present in ER, and GSK101 completely restored these expressions reduced by low glucose.

- In summary, HCl induces the expression of CYP24A1 and VDR by activation of lysosome via two mechanisms: HCl activates TRPV4, a calcium channel present in ER, which promotes the transfer of calcium from ER into the lysosome, and directly enters the lysosome through v-ATPase to promote acidification of the lysosomen.

- Finally, the lysosomal activation is known to activate the transcription factors TFEB and TFE3, and indeed, knockdown of TFEB or TFE3 reduced the expression of CYP24A1 and VDR respectively, proposing that the newly discovered LKB1-AMPK-glycolysis-H -Ca2 -TFEB/TFE3-CYP24A1/VDR-Vitamin D signaling axis could be an important mechanism inducing Vitamin D resistance by LKB1 mutation.

(출처 : Project Summary 7p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 요약문 ... 5
• Project Summary ... 7
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 가. 연구개발의 개요 ... 9
• 나. 국내ㆍ외 연구동향 ... 11
• 다. 연구개발의 필요성 및 중요성 ... 14
• 라. 연구개발의 최종목표 ... 15
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 16
• 가. 1차 연도: LKB1에 의한 CYP24A1 및 KYNU 발현 조절기전 규명 ... 16
• 나. 2차 연도: LKB1에 의해 조절되는 CYP24A1-비타민 D 및 KYNU-비타민 B3 경로를 이용한 항암전략 개발 ... 18
• 다. 3차연도 (수정): LKB1 돌연변이에 의한 비타민 D 항암효과 저항성 유발 기전 규명 및 극복 전략 연구 ... 19
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 20
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 51
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 54
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 63
• 7. 참고문헌 ... 64
• 8. 첨부서류 ... 65
• 끝페이지 ... 71