초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
□ 연구개발 목적(목표)
○ 최종 목표: 카바페네마제 생성 장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 개발
○ 세부 목표: 카바페네마제 생성 장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 평가, 카바페네마제 생성장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 개발
CRE는 tigecycline, colistin 등 일부를 제외한 대부분의 항생제에 내성이고 임상적으로 치료가 매우 어려우며 감염시 높은 사망률을 보임. WHO 분석에서도 carbapenem 내성 K. pneumoniae는 30일 사망률과 밀접한

□ 연구의 목적 및 내용
□ 연구개발 목적(목표)
○ 최종 목표: 카바페네마제 생성 장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 개발
○ 세부 목표: 카바페네마제 생성 장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 평가, 카바페네마제 생성장세균의 MALDI-TOF 질량분석키트 개발
CRE는 tigecycline, colistin 등 일부를 제외한 대부분의 항생제에 내성이고 임상적으로 치료가 매우 어려우며 감염시 높은 사망률을 보임. WHO 분석에서도 carbapenem 내성 K. pneumoniae는 30일 사망률과 밀접한 연관이 있음. 또한 CRE는 수직적 클론성 전파나 수평적 플라즈미드 매개 전이를 통해 쉽게 확산되므로 적극 적인 감염 관리가 필요. 따라서 장세균군에서의 carbapenem 내성은 국민 보건에 매우 큰 위협이 될 수 있고, 이에 대한 적절한 관리가 매우 중요함
본 연구에서는, MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여, 별도의 추가 과정 없이 카바페네마제 생성 장세균을 검출하는 검사법과 키트를 개발할 예정임. MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 직접 검출법은 1차 배양에서 증식 한 집락을 동정하기 위해 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하는 기관에서 검체 전처리 과정에 사용되는 방법을 개선하고, 주요 카바페네마제인 KPC, NDM 및 OXA-48 생성균주의 MALDI-TOF 질량분석기 분석 특성을 규명하여 새로운 진단 방법, 진단 키트 및 데이터베이스를 개발하고자 함
미생물 검사실에서 가장 많이 시행되는 배양 검사의 동정 과정에서 사용되는 MALDI-TOF 장비를 사용하여 별도의 추가 과정 없이 동정. 임상 미생물 검사실의 통상적인 업무 과정에서 다제내성균주의 확인이 조기에 이루어지므로 별도의 업무 부담이 추가되지 않음. 임상 검체와 감시배양 검체에 모두 적용이 가능. 추가되는 비용이 낮으며, 이미 MALDI-TOF 질량 분석기가 보급된 기관에 쉽게 적용이 가능
□ 연구개발 내용 1: 유전자 타입별 내성에 따른 E.coli와 K.pneumoniae 균주 신속검출법 개발
○ E.coli와 K.pneumoniae 균주의 유전자 타입별 내성균주의 확보(KPC-2, NDM-1, OXA-48, & ATCC)
○ 보다 많은 내성 유전자 특이적 피크를 측정하기 위한 현재 확립된 균주 동정을 위한 시료전처리 방법의 최적화 및 재현성 확인
○ 신속한 검출 및 키트화를 위한 분석 시간 단축 및 분석단계의 최소화 시도
○ 분석 시간 단축 및 분석 단계 최소화를 바탕으로 한 내성균주 신속검출법 확립
○ Large scale(100개 이상의 균주)에서 확립된 시료 전처리 방법과 신속 검출법 검증
○ 내성균주 유래 다양한 물질 탐색: 단백질, 지질/당관련 물질, 대사물질 등 (Triple-Tof 5600 및 Q-Exactive High Resolution MS를 이용한 확인 및 탐색)
□ 연구개발 내용 2: 내성여부에 따른 균주유래 물질 발굴/분리 및 동정
○ E.coli 또는 K.pneumoniae 균주에서 검출된 내성 균주 유래 특이적 물질 분리정제 시도
○ 텐덤 질량분석(MALDI-TOF/TOF; Triple-Tof 5600 및 Q-Exactive High Resolution MS를 이용)을 통한 내성관련 특이적 물질 동정(3개 이상)으로 내성 관련 물질 규명
□ 연구개발 내용 3: 내성 및 유전자 타입 진단을 위한 데이터 처리 및 알고리즘 개발
○ E.coli와 K.pneumoniae 균주의 유전자 타입별 동정으로 얻어진 질량분석값 리스트 작성 및 비교 분석
○ 확립된 신속 동정법으로 얻어진 질량분석값의 정확한 질량값을 얻기 위한 내부표준 물질 (Internal standard, IS) 테스트 및 선정 (2개 이상)
○ IS를 이용하여 E.coli와 K.pneumoniae 균주에서 유전자 타입별로 얻어진 질량 분석값 calibration
○ 동정 과정에서 얻어진 피크 smoothing/centroiding/threshold 값 설정으로 E.coli와 K.pneumoniae 균주 의 유전자 타입별 피크 리스트 확보
○ E.coli와 K.pneumoniae 균주의 공통 및 유전자 타입별 피크 라이브러리 구축
○ 균주별, 유전자 타입별 피크 라이브러리 비교 분석으로 내성 유무 판단 및 각 유전자 타입별 동정 여부 확 인
○ 균주별, 유전자 타입별 피크 라이브러리 비교 분석을 통한 알고리즘 개발 가능성 확인
○ 유전자 특이 피크에 대한 scoring 함수 최적화 및 내성 유무 결정을 위한 기준값 설정
○ 내성 유무 결정 및 내성 유전자 동정을 위한 알고리즘 확립
□ 연구개발 내용 4: 진단을 위한 소프트웨어 개발
○ 내성 유무 결정 및 내성 유전자 동정을 위해 확립된 알고리즘을 바탕으로 한 균주 내성 균주 동정 및 결과 분석 자동화를 위한 소프트웨어 개발
○ 개발된 소프트웨어 평가 및 구현 확인(Bruker biotyper 장비)
□ 연구개발 내용 5: 시작품 제작
○ 시작품 제작을 위한 키트 내부 구성품 확립
○ 시작품 내/외부 디자인(키트 내부 구성, 필수 표시 및 표기 사항 등 확인)
□ 연구개발 내용 6: 품목허가를 위한 임상시험
○ 실험실 규모의 (균종별 100개 이상) 균주 사전 테스트
○ 임상 시험을 위한 관련 연구자 교육
○ 임상 시험 사전 승인 (식약처)
○ IRB 승인 (1 세부과제)
○ 임상 시험 (유전자 타입별 100개 이상, 내성 없는 균종 포함 총 600개 균주 이상)
□ 연구개발 내용 7: cGMP 허가
○ cGMP 허가를 위한 장소 확보 (다이아텍코리아 1층 사무실 공간 활용)
○ cGMP 허가를 위한 신속 동정 검출법에 대한 SOP 작성 (시작품 구성)
○ cGMP 허가를 위한 시설 구축 및 허가
○ cGMP 허가 후, 임상 시험을 위한 제품 생산
□ 연구개발 내용 8: 품목허가를 위한 기술 문서 작성 및 허가 완료
○ 품목 허가를 위한 절차에 대한 교육
○ 다제 내성 신속 동정 키트에 대한 품목허가를 위한 각 단계별 기술 문서 작성
○ 기술 문서와 임상 시험 결과를 기반으로 한 품목 허가 신청 및 승인 완료

□ 연구 개발 성과
○ 질량분석 기반 카바페넴 내성 균주 신속 진단을 위한 CPE-KPC 직접 검출법 개발 및 제품화를 위한 최적화(전처리시간, 전처리 온도 조건, 원심분리 시간 및 온도 등)
○ 시제품 제작을 위한 제품 구성품 확립, 제품 박스 디자인 및 BI 설정
○ 진단을 위한 소프트웨어 개발: AP Viewer
- MALDI-TOF 질량분석 결과로부터 CPE-KPC 진단을 위한 알고리즘 개발
- CPE-KPC 내성 유무 진단을 위한 컷오프 값 설정
- AP Viewer 알고리즘 검증
○ Aprodete CPE-KPC Kit의 임상적 유효성 확인을 위한 임상 시험
- 연구제목: MALDI-TOF MS를 이용한 KPC 생성 균주 신속 검출 키트 Aprdete CPE-KPC의 성능평가 및 임상적 유용성 평가
- 신청 일자 및 과제 승인 번호: 2018.08.06, 3-2018-0200
- 연구책임자 및 의뢰자: 정석훈(강남세브란스 진단검사의학과)/강남세브란스 병원
- 연구 예정 기간:2019.03.05 ~ 2019.04.30
- 임상 시험 완료 - 임상시험 결과 보고서
(총 387 검체 테스트: 임상적 민감도: 100%, 임상적 특이도: 98.85%)
○ Aprodete CPE-KPC Kit 제조 허가(품목허가)를 위한 시험 및 인증
- 품질관리 기준 적합인정서 및 제조 허가 획득을 위한 3 batch 생산
- 제품 생산을 위한 의료기기 제조 및 품질관리 기준 적합인정서(KGMP 인정서)
(임상GMP 인정번호: KTR-CAB-5042, KGMP 인정번호: KTR-AAB-5774)
- 해외 수출을 위한 ISO13485 인증(Certificate Registration No.:SX60143031 0001)
- Aprodete CPE-KPC Kit 제품의 임상적 유효성을 평가하기 위한 임상 시험
- Aprodete CPE-KPC Kit 제품의 분석적 성능 시험, 안정성(유효기간 설정) 및 유효성 시험
- Aprodete CPE-KPC Kit 제품 허가를 위한 기술문서(개발 및 생산문서) 작성
- Aprodete CPE-KPC Kit의 제조허가(품목허가) 완료
(의료기기 제조허가증:Aprodete CPE-KPC Kit, 제허 19-747호)
○ 특허 출원을 통한 질량분석법을 이용한 신속 분석법에 대한 원천기술 확보
(국내 특허 등록 1개, 해외 특허 출원 2건(PCT, 미국), SCI 논문 1개)
○ 임상적 • 학문적 유효성 확인을 위한 SCI 논문 발표(Publish 중임)
- Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2020 Jan 03 Accepted,
- Title: Direct Detection of Intact Klebsiella pneumoniae Carbapenemases Produced by Enterobacterales Using MALDI-TOF MS
- Auther:YOON, Eun-Jeong; LEE, Eun Hee; HWANG, Dong Hwi; Lee, Hyukmin; BAEK, Je-Hyun; Jeong, Seok Hoon
○ 항생제 다제 내성 신속 동정을 위한 기틀 마련
(KPC 유전자 외에 NDM과 OXA 등의 CPE 유전자 진단을 전처리 방법 개발 및 MRSA와 VRE 등의 항생제 내성 신속 진단 키트 개발을 위한 기틀 마련)
○ 안전성, 유효성 기반 신의료기술 평가를 받기 위하여 건강보험심사평가원에 평가 신청. 요양급여대상 • 비급여 대상 여부 확인 신청
- 요양급여대상 • 비급여대상으로 확인되지 않음(신의료기술 평가 신청대상)
- NECA(신의료기술평가사업본부)에 신의료기술 평가 신청 진행 중
○ NDM과 OXA 등의 CPE 유전자 진단 키트 개발을 위한 전처리 테스트
- 다양한 detergent 테스트(Non-ionic, zwitter ionic, anionic detergent), Lysozyme, NDM &OXA CPE 활성화 테스트(Ammonium bicarbonate, ZnCl2), B-PER buffer & BugBuster buffer 테스트

□ 연구개발성과의 활용계획(기대효과)
○ 기술적 측면
- 전통적인 내성균주 동정은 최대 2~18시간이 필요하지만, 수분 내에 동정 가능
- 민감도가 높아 미량의 균 집락으로 분석 가능(1개의 colony로 진단 가능)
- 전처리 과정이 간단하며 분석 과정이 자동화되어 사용자가 쉽게 접근할 수 있음
- 장비 구입을 제외한 시약 구입 비용이 다른 동정 방법에 비해 저렴함
- 개발 기술은 항생제 내성 균주로부터 내성을 대표하는 관련 물질을 신속하게 검출 할 수 있는 일반적인 방법으로도 사용가능. 질량분석기술이 기본으로 활용되기 때문에 다양한 질량분석기술 응용분야로의 확장을 기대함
- 질량분석기술과 적절한 시료전처리 기술을 접목함으로써 두 분야가 가지고 있는 장점을 극대화하여 새로운 의료기술과 활용될 수 있음
- 기존의 균주 동정 기술의 응용으로 내성 균주 특이적 물질을 분석하는 기술은 기존에 질량분석을 이용한 동정기술을 활용하고 있는 기관에서는 이 기술의 보급이 매우 신속히 진행될 수 있을 것으로 기대됨
- 이 기술의 확립은 타종의 병원체 동정 및 내성유무 판단에도 매우 빠른 접목과 적용이 이루어질 수 있기 때문에 시료전처리/분획기술의 추가 기술개발이 필요할 것으로 판단됨
- 라이브러리 구축 방법 확립과 신속 내성유무를 판단하기 위한 알고리즘 개발로 다른 종류의 항생제내성 진단키트 개발에 적용 가능하며, 개발 기간 단축 효과를 기대.
○ 경제적산업적 측면
- MALDI-TOF 질량 분석기는 임상미생물 검사실의 표준 장비로 자리매김을 하고 있음
- 별도의 추가 과정 없이 동정을 시행하는 중에 다제내성 균주를 확인할 수 있어, 환자의 조기 치료와 감염 관리에 있어서 효율성을 극대화할 수 있음
- 빠르고 정확한 동정결과는 빠르게 항생제를 처방할 수 있어 환자의 생존율을 높이고, 입원기간을 감소시킬 수 있어 환자의 의료비 부담을 감소시킬 수 있음.
- 빠르고 정확한 항생제 처방으로 항생제 내성 균주 발생을 억제할 수 있음.
- 장비 구입을 제외한 시약 구입 비용이 저렴하여 환자의 부담을 줄일 수 있음.
- 신속하고 정확한 항생제 사용은 항생제 내성 발생을 억제함으로써 국민 보건 향상에 기여할수 있음.
- 국민 보건의 측면에서 다제내성균에 의한 추가 비용, 재원 기간 연장, 사망률 증가 등의 부담을 경감할 수 있음
- 질량분석을 이용한 의료기술은 정확성, 신뢰도, 및 확장성이 크기 때문에 고부가가치 창출이 가능한 미래 산업임
- 850병상 규모의 1세부 주관기관에서 2016년 1-6월 사이에 MALDI-TOF 질량 분석기로 동정한 그람음성 막대균의 숫자는 3,000여 균주임
- 현재 국내에서 30대의 MALDI-TOF 질량분석기가 의료기관에서 사용 중이며, 전 세계적으로 1500대의 MALDI-TOF 질량분석기가 임상미생물 검사실에서 사용되고 있음
- 산업적 측면으로 본 연구에서 개발한 방법과 키트를 MALDI-TOF 질량분석기를 운영하는 모든 검사실에서 사용하게 되면 안정적인 시장 확보가 가능
- 또한 지속적인 데이터 베이스 업데이트로 장기적인 시장의 확보도 가능 - 내성 유무를 판단할 수 있는 분자 마커를 동정하여 이 물질을 타겟으로 새로운 항생제 개발 및 응용으로 새로운 시장을 창출할 수 있음.
- 높은 정확도와 민감도를 갖는 고감도 진단기술의 개발을 바탕으로 기술적 우위를 선점하여 국내 산업성장에 기여하고자 함.
- 현재까지 내성균주의 내성유무를 신속히 확인할 수 있는 방법이 전세계적으로 필요한 실정으로 관련 개발 기술은 국내 특허 등록이 완료되었으며, 현재 해외 PCT 출원 및 미국 국내진입단계에 있음. 원천 산업 재산권으로 확보하고 있음.
- 원천기술 확보를 통해 의료진단의 영역 확장이 기대될 뿐 만 아니라 세계 시장의 우위를 점할 수 있음. 또한 제품으로 개발시 세계 시장을 향한 막대한 부가가치를 창출 할 수 있음.

(출처 : 국문 요약문 4p)

Abstract ▼

□ Purpose&Contents
In this study, a MALDI-TOF mass spectrometer will be used to develop assays and kits for detecting carbapenemase-producing enterobacteriaceae without additional steps. Direct detection using the MALDI-TOF mass spectrometer improves the method used for sample pretreatment in ins

□ Purpose&Contents
In this study, a MALDI-TOF mass spectrometer will be used to develop assays and kits for detecting carbapenemase-producing enterobacteriaceae without additional steps. Direct detection using the MALDI-TOF mass spectrometer improves the method used for sample pretreatment in institutions using the MALDI-TOF mass spectrometer to identify colonies grown in primary cultures, and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae including KPC and To characterize MALDI-TOF mass spectrometry analysis to develop new diagnostic kits and databases

□ Results
The findings of this study are challenging to develop a rapid detection method that can identify carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, which can cause serious harm to public health, by using MALDI-TOF mass spectrometer. The identification of conventional resistant strains requires up to 2 to 18 hours, but since it can be identified within minutes, it can contribute to the public health as it can prevent the spread of resistant strains through rapid treatment and infection control using appropriate antimicrobial agents of infected patients. Judging.
In addition, based on the development of highly-sensitive diagnostic technology with high accuracy and sensitivity, it can contribute to domestic industrial growth by preoccupying technological advantage, and considering the need for a method that can quickly check the tolerance of resistant strains worldwide, Patents can be registered overseas and abroad and can be secured with original industrial property rights. The secured source technology is expected to expand the scope of medical diagnosis and create enormous added value for the global market.

□ Expected Contribution
Development for rapid identification and determination of genotype of carbapenem-resistant strains can be done for commercialization and commercialization through the establishment of GMP facilities, clinical trials, and product approval processes for research and development methods
The product to be developed in this project can be directly applied to the microorganism identification process using MALDI-TOF equipment which is currently performed in the department of diagnostic examination medicine and clinical specimen inspection institution of universities and general hospitals. This development lays the foundation for the development of antibiotic multidrug resistance rapid identification kit using mass spectrometry.

(출처 : SUMMARY 8p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 국문 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 8
• 영문목차 ... 9
• 목차 ... 10
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 11
• 1-1. 연구개발 목적(목표) ... 11
• 1-2. 연구개발의 필요성 ... 14
• 1-3. 연구개발 범위 ... 17
• 1-2. 연구개발 대상의 국내외 현황 ... 20
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 24
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 26
• 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 83
• 4-1. 목표달성도 ... 83
• 4-2. 관련분야 기여도 ... 85
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 87
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 88
• 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 88
• 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 88
• 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 89
• 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 89
• 11. 기타사항 ... 89
• 12. 참고문헌 ... 90
• [별첨3] 실적 증빙자료 ... 92
• [별첨4] 기타 첨부서류 ... 104
• 끝페이지 ... 106