초록 ▼

□ 연구의 목적 및 내용
2013년에 보고되어 활발히 연구되기 시작한 수퍼 인핸서 (super-enhancer)는 크기, 전사인사 결합 정도, 유전자 발현 활성의 세기 면에서 기존에 알려진 인핸서 (enhancer)와는 구별되는 특징을 보여주며, 세포특이적인 특성을 갖는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 암을 포함한 여러 가지 질병의 발병에도 밀접한 연관이 있을 것으로 예상된다. 이러한 특성으로 인해 수퍼 인핸서 연구는 향후 질병 치료제 개발에도 중요한 정보를 제공할 것으로 기대된다.
Cytokine-sens

□ 연구의 목적 및 내용
2013년에 보고되어 활발히 연구되기 시작한 수퍼 인핸서 (super-enhancer)는 크기, 전사인사 결합 정도, 유전자 발현 활성의 세기 면에서 기존에 알려진 인핸서 (enhancer)와는 구별되는 특징을 보여주며, 세포특이적인 특성을 갖는데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 암을 포함한 여러 가지 질병의 발병에도 밀접한 연관이 있을 것으로 예상된다. 이러한 특성으로 인해 수퍼 인핸서 연구는 향후 질병 치료제 개발에도 중요한 정보를 제공할 것으로 기대된다.
Cytokine-sensing 수퍼 인핸서 및 관련 transcription factor들의 생체 내 (in vivo) 기능을 알아보기 위해, 2세대 CRISPR 기반 유전체교정기술인 염기교정유전자가위 (base editor)를 이용하여 mouse casein 수퍼 인핸서를 구성하는 각각의 DNA element를 편집한 mouse 모델을 만들고, 이를 통해 생체 내에서 수퍼 인핸서가 정상적인 세포 발달과 질병 발병에 있어 어떤 영향을 미치는지, 또 이것은 어떤 메커니즘에 의한 것인지 규명하려 한다.

□ 연구개발성과
Casein super-enhancer를 이루는 개별 enhancer 중 3개의 enhancer를 targeting하는 염기교정유전자가위를 디자인하였다. 각각의 유전자 가위는 주요 전사인자가 기능하는데 중요할 것이라 예측되는 motif를 editing 하면서도 mouse 전체 genome내에서 off-target을 최대한 갖지 않도록 디자인하였다. 각각의 유전자 가위당 평균 100여개의 mouse embryo에 유전자 가위를 RNA상태로 micro-injection한 뒤 surrogate mother에게 착상시켰고 한 개의 유전자 가위 당 평균 7%의 효율로 founder mouse를 얻을 수 있었다. Founder mouse의 genotyping 결과 모두 WT의 genotype을 얻었고, 이는 해당 sgRNA가 실제로 mouse embryo에서 inactive하였기 때문일 것으로 추측된다. 새로운 DNA 서열을 target으로 하는 염기교정 유전자 가위를 추가로 디자인 하여 같은 실험을 진행해 본 결과, 역시 WT의 founder만을 얻었고, 이를 통해 Base editing을 통한 transgenic mouse를 얻는데 있어 sgRNA design의 success rate이 기대했던 만큼 높지 않다는 것을 확인하였다. Mouse embryo editing을 위한 염기교정 유전자 가위 디자인 및 선별에 있어 in vitro 또는 in cell 플랫폼에서 많은 수의 sgRNA의 활성을 미리 테스트 하는 과정이 선행되는 것이 매우 중요함을 알 수 있었다.

□ 연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
질병 발생 및 진행에 있어 스테로이드 호르몬 (steroid hormone)과 사이토카인 (cytokine)의 역할은 이미 잘 확립되어 있다. 사이토카인에 의해 시작된 신호 전달 경로는 조혈 질환의 요인이며, 전사 인자(transcription factor)와 슈퍼 인핸서(super-enhancers)가 그것의 교점(node)에 있다고 제안되어왔다.
Cytokine-sensing super-enhancer에 대한 이 연구는 백혈병(leukemia)에서 super-enhancer의 역할을 연구하기 위한 시작점을 제공할 것이다. 이 연구에서사용할 방법인 CRISPR base editing기술은 사이토카인과 스테로이드 호르몬 이 super-enhancers를 어떻게 활성화시키는지 이해하는데 매우 중요한 핵심 기술로써 궁극적으로는 후속 연구인 백혈병에서 슈퍼 인핸서의 원인 및 역할을 조사하기 위해서도 base editing 기술을 사용할 것이고, 더 나아가서는 백혈병 환자에서 발견되는 돌연변이를 교정하는 환자 맞춤형 유전자 치료제로서의 유효성 및 안정성도 이번 실험과 같은 플랫폼에서 테스트해 볼 수 있을 것으로 기대된다.
다만 이 기술을 직접 적용하는데 있어 효율성 부분에 대한 optimization이 선행되어야 할 것으로 예상된다.

(출처 : 국문 요약문 4p)

Abstract ▼

□ Purpose&Contents
Super-enhancers, first reported in 2013 and actively being studied, show distinctive features from known enhancers in terms of size, degree of transcriptional binding, and strength of gene expression activity.
Super-enhancers are highly enriched for the master transcription

□ Purpose&Contents
Super-enhancers, first reported in 2013 and actively being studied, show distinctive features from known enhancers in terms of size, degree of transcriptional binding, and strength of gene expression activity.
Super-enhancers are highly enriched for the master transcription factors that drive cell-type-specific gene expression program, which makes them play key roles in defining mammalian cell identity and thus be closely linked to onset of various diseases including cancer. Super-enhancers are found at key disease-causing genes, which implies the potential of discovery of therapeutics targeting components of super-enhancers in diverse diseases. To investigate the in vivo function of the cytokine-sensing super-enhancer and related transcription factors, we will use a base editor, a second-generation CRISPR-based genome modification technique, to create mouse models having edited DNA elements of mouse casein super-enhancers. Through this, we willdetermine how and by what mechanisms super-enhancers affect normal cell development and disease development in living organisms.

□ Results
Base editors were designed to target 3 enhancers among the constituent enhancers that form casein super-enhancer. Each base editor was designed to edit the base within the motif sequences of master transcription factors of casein locus while minimizing putative off-target sites within the entire mouse genome. About 100 mouse embryos per base editor were micro-injected as RNA form and then implanted into the surrogate mothers, and founder pups were obtained with an average efficiency of 7% per base editor.
The genotyping of the founder mouse resulted in the WT genotypes, presumably because the sgRNAs were actually inactive in mouse embryos. The same experiment was conducted by designing additional base editors targeting a new DNA sequences, and as a result, only the WT founder was obtained. Through this results, we confirmed that the success rate of sgRNA activity of base editorsin the mouse embryo were not as high as expected in getting the transgenic mouse. We found the importance of the process of pre-testing the activity of a large number of sgRNAs on the in vitro or in cell platforms in designing and screening base editors for mouse embryo editing.

□ Expected Contribution
The role of steroid hormones and cytokines in disease development and progression is well established. Signal transduction pathways initiated by cytokines are a factor in hematopoietic diseases, and transcription factors and super-enhancers have been proposed at their nodes. This study of cytokine-sensing super-enhancers will provide a starting point for studying the role of super-enhancers in leukemia. CRISPR base editing, the method used in this study, is a key technology in understanding how cytokines and steroid hormones activate super-enhancers. Base editing technology will be used, and furthermore, the effectiveness and stability of patient-tailored gene therapy to correct mutations found in leukemia patients will be tested on the same platform. However, the optimization of efficiency should be preceded in applying this technology into this application.

(출처 : SUMMARY 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1제 출 문 ... 2보고서 요약서 ... 3국문 요약문 ... 4SUMMARY ... 5목차 ... 61. 연구개발과제의 개요 ... 7 1-1. 연구개발 목적 ... 7 1-2. 연구개발의 필요성 ... 7 1-3. 연구개발 범위 ... 72. 국내외 기술개발 현황 ... 83. 연구수행 내용 및 결과 ... 84. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 10 4-1. 목표달성도 ... 10 4-2. 관련분야 기여도 ... 105. 연구결과의 활용계획 ... 106. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 107. 연구개발성과의 보안등급 ... 108. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 109. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 1110. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 1111. 기타사항 ... 1112. 참고문헌 ... 11[별첨4] 실적 증빙자료 ... 12[별첨5] 일반인을 위한 보고서 요약서 ... 14[별첨6] 한·미 보건의료 인력교류지원사업 연수 활동 종료보고서 ... 15끝페이지 ... 34