[보고서]대장암 발달의 새로운 핵심 인자인 Thrombospondin-4의 분비 기작 분석 및 약물 스크리닝

이문영

대장암 발달의 새로운 핵심 인자인 Thrombospondin-4의 분비 기작 분석 및 약물 스크리닝
Analysis of the secretion molecular dynamics of THBS4, new key factors of colorectal cancer development and drug screening 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	원광대학교 WonKwang University
연구책임자	이문영
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2021-06
과제시작연도	2021
주관부처	교육부 Ministry of Education
등록번호	TRKO202100011358
과제고유번호	1345335854
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2022-04-30
키워드	대장암.신생혈관생성.칼슘.Colon cancer.PDGFR beta.THBS4.Angiogenesis.Calcium.

초록 ▼

□ 연구개발 목표 및 내용
￭ 최종 목표
THBS4의 분비로 인해 암이 발달하는 기작을 밝혀내어 대장암의 효율적인 치료를 위한 기초 마련하고자 한다.
￭ 전체 내용
본 연구진이 지속적으로 관찰하고 연구해온 PDGFRβ와 THBS4가 대장암 조직에서 크게 증가한 것을 확인하였고 PDGFRβ경로를 통해 THBS4의 분비가 증가하는 기작을 밝혀내고자 한다.

□ 연구개발성과
1. 본 연구진은 대장암 환자의 정상조직과 비교하여 종양조직에서 THBS4 및 PDGFR β의 수준이 크게 증가한 것을 확인하였다.
2. 두 단백질 간의 밀접한 연관관계가 있음을 확인하고자 PDGFRβ의 ligand를 분석하여 PDGF-D가 TGFβ에 의해 증가하는 사실을 밝혀내었다.
3. TGFβ 및 PDGF-D가 THBS4의 분비를 유도한다는 것을 확인하였다.
4. PDGFRβ 억제제, IP3R 억제제, STIM1 억제제를 사용한 결과 THBS4의 분비가 감소한 결과로 Ca2+이 THBS4의 분비에 관여하는 것으로 확인되었다.
5. THBS4의 분비 기작을 분석하기 위해 시간별로 확인한 결과, TGFβ에 의해 PDGF-D가 증가하고 분비되어 PDGFRβ를 자극한다. 이후 IP3R이 자극되어 Ca2+에 의해 THBS4의 분비가 유도된다는 것을 확인하였다.
6. 각각의 억제제를 단일 또는 조합하여 처리하여 배양한 대장암세포의 배지를 CCD-18co 세포에 처리하여 배양한 결과, 세포의 이동, 부착, 증식을 증가시켰다.
7. 트롬빈의 처리는 6번 결과를 더욱 증가시키는 것을 확인하였다.

□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
1. THBS4는 대장암의 발달 및 전이에 관여할 것으로 생각되기 때문에 이 인자는 대장암에 대한 강력한 예후 바이오마커로서의 가능성이 있다.
2. 본 연구과제의 결과들은 대장암의 완전한 이해와 효과적인 진단 및 치료를 위해서 반드시 밝혀져야 할 내용이다. 따라서 THBS4와 관련된 인자들과 그 기작을 밝힘으로써 대장암에 대한 새로운 이해와 나아가 새로운 바이오마커와 약물을 도출할 수 있다.
3. THBS4는 중요한 예후인자의 가능성을 나타내고 있기 때문에 기존의 진단 및 치료 체계를 강화하여 의학적 및 경제적 의료복지를 실현할 수 있다.
4. 추후 다른 연구들과 연계하여 더욱 뛰어난 연구결과를 도출해냄으로써 과학기술적, 경제적, 사회적으로 큰 기여를 할 수 있다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
요 약 문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 7
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 11
1) 대장암에서 THBS4와 PDGFRβ의 발현 ... 11
2) TGFβ에 의한 PDGF-D mRNA와 단백질 발현 증가 ... 12
3) THBS4의 분비에 대한 TGFβ와 PDGF-D의 영향 ... 13
4) Ca2+ 신호 단백질 knockdown에 의한 THBS4 분비 감소 ... 14
5) PDGF-D, PDGFRβ 및 Ca2+ 신호 단백질에 의한 THBS4 증가 ... 15
6) 대장암 세포에서의 PDGFRβ자극에 의한 대장 근섬유아세포의 부착, 이동, 증식 촉진 ... 16
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 18
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
6. 참고문헌 ... 19
끝페이지 ... 20

표/그림 (9)

표 Information on 12 CRC patients
표 The sequence of primers
표 Co-immunofluorescence and immunoblots for THBS4 and PDGFRβ in normal and tumor tissues of colon cancer patients. (A) Immunofluorescence with an anti-THBS4 antibody (green) and anti-PDGFRβ antibody (red) on normal (N) and tumor (T) tissues of colon cancer patients. (B) Western blot with anti-THBS4 and anti-PDGFRβ antibodies on normal and tumor tissues of colon cancer patients. * P < 0.05, compared with normal tissue, t-test
표 Effect of TGFβ on mRNA levels of THBS4, PDGFRβ, and PDGFRβ ligands. Relative mRNA expression levels as determined with real-time PCR for (A) PDGFRβ, THBS4, (B) PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, and PDGF-D of DLD-1 cells cultured in the presence (TGFβ 10mM) or absence (control) of TGFβ for 12 h.(C) Western blot with anti-PDGF-D, p-PDGFRβ, and PDGFRβ antibodies in DLD-1 cells cultured in the presence (TGFβ 10 μM) or absence (control) of TGFβ for 12 h. Three independent experiments were performed in duplicate. * P < 0.05, compared with control, t-test
표 Effect of TGFβ or PDGF-D on THBS4 of lysate and cultured medium of DLD-1 cells. (A) Western blot with anti-THBS4 antibody in whole cell lysate (left panel) or cultured medium (right panel) of DLD-1 cells cultured in the presence of TGFβ (1, 2, 5, 10 and 20 μM) for 20 h or PDGF-D (1, 2, 5, 10 and 20 μM) for 8 h. (B) Relative mRNA expression levels as determined with real-time PCR for THBS4 of DLD-1 cells cultured in the presence (black) or absence (gray) of PDGF-D (20 μM) for 8 h. Three independent experiments were performed in duplicate. * P < 0.05, compared with control, t-test
표 Effect of PDGF-D stimulation of THBS4 after blockage of PDGFRβ, IP3R, and STIM1. (A) Western blot with anti-THBS4 antibody in whole cell lysate (left panel) or cultured medium (right panel) of DLD-1 cells cultured with PDGF-D (20 μM) for 8 h in the presence of imatinib (0, 0.2, 0.5, 1, 2, and 5 μM) for 16 h, 2-APB (0, 5, 10, 20, 50, and 100 μM) for 16 h, or ML-9 (0, 5, 10, 20, 50, and 100 μM) for 16 h, respectively. (B) Western blot with anti-THBS4 antibody in whole cell lysate or cultured medium of DLD-1 cells transfected with siIP3R or siSTIM1 and cultured with PDGF-D (20 μM) for 8 h. (C) Relative mRNA expression levels as determined with real-time PCR for THBS4 of DLD-1 cells cultured with PDGF-D (20 μM) for 8 h in the presence of imatinib (5 μM) for 16 h, 2-APB (100 μM) for 16 h or ML-9 (100 μM) for 16 h, respectively. Three independent experiments were performed in duplicate. * P < 0.05, compared with control, t-test
표 Effect of imatinib and 2-APB on THBS4 regulation by TGFb and PDGF-D in a time-dependent manner. (A) Western blot with anti-PDGF-D and anti-THBS4 antibodies in the presence of TGFβ 10 mM (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h) or with anti-THBS4 antibody in the presence of PDGF-D 20 mM (0, 4, 8 and 12 h) in DLD-1 cells. (B) Western blot with anti-PDGF-D and anti-THBS4 antibodies in the presence of TGFβ 10 mM (0, 4, 8, 12, 16, 20 and 24 h) or with anti-THBS4 antibody in the presence of PDGF-D 20 mM (0, 4, 8 and 12 h) in DLD-1 cells cultured with imatinib 5 mM for 16 h. (C) Western blot with anti-PDGF-D and anti-THBS4 antibodies in the presence of TGFβ 10 mM (0, 4, 8, 12, 16, 20 and 24 h) or with anti-THBS4 antibody in the presence of PDGF-D 20 mM (0, 4, 8 and 12 h) in DLD-1 cells cultured with 2-APB 100 mM for 16 h. The graphs in the right panel represent the relative expression of PDGF-D (black line with closed circle); THBS4 (red line with open circle) in relation to exposure (time, h) with TGFb; and the relative expression of THBS4 after the addition of PDGF-D (green line with closed triangle) through 12 h Three independent experiments were performed in duplicate. * P < 0.05, compared with 0 h, t-test
표 Effect of DLD-1 cell conditioned medium (CM) stimulated with PDGF-D and additional thrombin treatment on CCD-18co cells. (A) and (B) Adhesion and migration of CCD-18co cells cultured with DLD-1 CM stimulated with PDGF-D (P), imatinib (I), I + P, 2-APB (A), A + P, ML-9 (M) and M + P. DLD-1 cells were treated with imatinib 5 mM, 2-APB 100 mM or ML-9 100 mM for 16 h, and then PDGF-D 20 mM additionally treated for 8 h. (C), (D) and (E) CCD-18co cells were cultured with CM or CM with thrombin (1 U/mL) (CM+T) of DLD-1 cells stimulated with PDGF-D 20 mM for 8 h and subjected to an adhesion assay, migration assay, and an MTT assay. All experiments were performed in duplicate in three independent experiments. * P < 0.05, compared with normal or CM, t-test
표 Model representing possible molecular pathways by which PDGFRβ and THBS4 cause the development of colorectal cancer

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