[보고서]PEBP1의존적 자가포식에 의한 산화스트레스 조절 기전 연구

김덕룡

[국가R&D연구보고서] PEBP1의존적 자가포식에 의한 산화스트레스 조절 기전 연구
Regulation of oxidative stress responses via PEBP1-dependent autophagy 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	경상대학교 GyeongSang National University
연구책임자	김덕룡
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-06
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202100012581
과제고유번호	1345316739
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2021-08-21
키워드	자가포식.활성산소.산화스트레스.시스템 생물학.유전자 네트워크.PEBP1.MAPK14/p38a.p62.Keap1.

초록 ▼

□ 연구개요
산화스트레스에서 세포 항상성 유지를 위한 자가포식의 역할은 이전 연구들에 의해 제시되었지만, PEBP1과 연계한 자가포식 의존적 산화스트레스 조절은 명확하지 않음. 본 연구는 PEBP1에 의해 의존적으로 조절되는 자가포식을 통해 항산화 단백질 Keap1이 조절됨을 밝혔고, 산화스트레스 조건에서 세포는 자가포식을 이용하여 항상성을 유지하였음. 이런 항상성 유지 기전을 PEBP1의 분자적 기능을 통해 규명하였음. 또한, 시스템 생물학적 분석을 기반으로 산화스트레스가 유도된 세포주에서 일어난 자가포식 관련 유전자의 발현을 분석하고, 자가포식과 산화스트레스 유전자간의 네트워크를 확보하였음. 이런 연구 결과들은 스트레스 조건에서 세포의 생존력을 증가시키는 자가포식작용의 핵심적인 기전이해뿐만 아니라 자가포식 관련 질환들의 발병기전 이해에도 많은 정보를 제공할 것으로 사료됨.

□ 연구 목표대비 연구결과
본 연구는 PEBP1의존적 자가포식에 의한 산화스트레스 조절 기전을 규명하고자 하였음. 활성산소 축적으로 인한 세포 사멸이 PEBP1 과발현으로 인해 증가함을 보였고, 항산화 유전자 발현을 촉진하는 전사인자인 Nrf2의 감소를 확인함. 또한, PEBP1 발현조절에 따라 자가포식 단백질인 p62의 인산화가 반비례하는 경향성을 확인하고 p62 단백질의 349번 잔기의 인산화가 Keap1과의 결합력을 증가시켜 자가포식을 통한 분해를 촉진함을 제시하였음. 세포 면역 염색법을 통하여 Keap1과 p62의 co-localization을 확인하였고, PEBP1의 과발현은 이들의 co-localization을 감소하는 결과를 얻었음. PEBP1은 직접적인 인산화 활성이 없으므로 DB를 기반으로 p62와 상호작용하여 인산화 관련성을 PEBP1와 연계하여 새로운 kinase 유전자를 검색한 결과 p38a 중요성이 제시되었음. 이를 기반으로 산화스트레스 조건에서 자가포식 조절기전을 조사하였음. 정제된 MAPK14/p38a 단백질를 이용하여 In Vitro kinase assay 결과 p62의 serine 349번 잔기에 인산화가 일어남을 확인하였음. 이러한 결과는 PEBP1의 과발현에 의해서 일어나는 p62의 인산화가 줄어드는 것을 MAPK14에 의해 설명할 수 있으며, PEBP1의존적 자가포식 조절을 통한 Keap1의 분해하고, 결과적으로 Nrf2의 전사 활성을 증가시킴으로써 산화스트레스 반응을 유도함을 확인하였음. 이는 산화스트레스와 RKIP에 의한 자가포식의 상호 연관성을 제시하였음. 더불어, PEBP1와 암 관련 단백질인 MTDH의 발현 억제에 의해 촉진됨과 암세포의 이동능력이 조절됨을 확인하였고, 시스템 생물학적 분석을 기반으로 산화스트레스에 의해 발현이 유의미하게 조절된 자가포식 관련 유전자 그룹을 통해 새로운 표적 단백질들을 제시하였음.

□ 연구개발결과의 중요성
본 연구를 통해 자가포식 의존적으로 산화스트레스를 극복할 수 있는 기전을 PEBP1을 통하여 규명함은 자가포식과 산화스트레스와 연관된 다양한 세포 기전에서 활용될 수 있음. 산화스트레스는 세포 사멸을 일으키는 가장 흔한 기전일 뿐만 아니라 노화의 진행에서 중심이 되는 세포 기전임. 세포의 생존과 밀접한 관련이 있는 산화스트레스와 자가포식 모두에 관여하는 새로운 분자 표적은 다양한 질병 치료제 개발에 중요한 표적으로 제시될 수 있음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
3. 연구개발결과의 중요성 ... 14
(1) 연구개발결과의 활용방안 ... 14
(2) 연구결과에 대한 기대성과 ... 15
4. 참고문헌 ... 15
5. 연구성과 ... 16
끝페이지 ... 19

표/그림 (13)

표 Oxidative response in PEBP1-overexpressing cells (A) Determination of intracellular ROSs . (B) Cell viability of PEBP1-overexpressing cells (CCK8 assay), expression of LC3-II, NRF2, and NQO1 (Western blot), and transcriptional activation of NRF2 target genes (Real-time PCR assay)
표 Autophagy-dependent KEAP1 degradation (A) Keap1 degradation and NRF2 activation in PEBP1-overexpressing cells. (B) Keap1 degradation and NRF2 activation in PEBP1-deficient cells
표 The role of p38/MAPK14 in p62 phosphorylation during the KEAP1 degradation (A) Colocalization of p62/SQSTM1 and KEAP1 in PEBP1-overexpressing cells (immunostaining assay). (B) String data base to predict the p62-MAPK14 interaction. (C) MAPK14/p38-dependent p62 phosphorylation (western blot)
표 PEBP1 and MTDH interaction in autophagy (A-C) Expression of MTDH and PEBP1 in control and MTDH knockdown of three Breast Cancer cell lines. (D-F) MTDH and PEBP1 interaction and their role in autophagy
표 Gene clustering between PEBP1 and autophagy in prostate cancers (A) Gene clustering of PEBP1 and autophagy genes. (B-D) Expression pattern of PEBP1 and autophagy-related genes. (E) Networks of PEBP1 and autophagy genes
표 Network analysis of autophagy in the oxidative stress (A) Clustering of autophagy and oxidative stress response genes. (B)Correlation between autophagy and cancer genes under the oxidative stress. (C) Gene Ontology(GO) analysis in the oxidative stress
표 RKIP profile in cancer tissues (A) The expression of RKIP in cancer vs normal tissues. The empirical cumulative distribution function (ECDF) of the expression of RKIP in (n¼31) tumor types paired with the corresponding normal tissues was obtained through GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn). The ECDF of the number of cases containing (B) altered RKIP copy numbers vs non-altered and (C) mutated RKIP vs non-mutated different cancer studies(n¼240). The mutations and CNA data were obtained from cBioPortal(http://www.cbioportal. org)
표 Regulation of autophagy in response to oxidative stress (A) Clustering of autophagy and response to oxidative stress genes by their pairwise. (B-C) Module correlation and over-representation in sample groups. (D) Graph top nodes by module and gene ontology category. (E) Novel interactions of autophagy and oxidative stress
표 BECN1 is specifically cleaved under oxidative stress. (A) Intracellular ROSs level. (B) Cell viability under the oxidative stress. (C-D) Beclin1 cleavage under the oxidative stress. (E, F) Beclin1 cleavage in the different cells or conditions
표 MAPK14/p38a phosphorylate p62 at serin 349 and PEBP1 regulate cell viability in oxidative stress (A) Protein expression change in PEBP1 knockout cell line. (B) Cell viability of H1299-RKIP knockout cell. (C) PEBP1 affect to cell migration. (D) P62 protein purification. (E) MAPK14 phosphorylate p62 in vivo kinase assay
표 PKA is highly activated during β-Lap-induced apoptosis. (A) Western blots. The 231-NQO1+/+ (left) and 231-NQO1-/- (right) cells were treated with β-Lap (0 μM, 2 μM, 3 μM, and 4 μM) for 2 h and further incubated in fresh medium with 5 % FBS for 4 h. b-actin was used as a loading control. (B–E) Quantification of protein expression and activation
표 ATG7 knockdown rescues SNAI1 degradation H1299 (A) or HeLa (C) cells were transiently transfected with ATG7 shRNA and control shRNA. (B– E) Quantification of protein expression and activation
표 transcription factor/microRNA-gene expression correlations Dot plot of transcription factor/microRNA-gene expression correlations. Joy plots of the density of transcription factor/microRNA expression correlations with all known genes

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