[보고서]만성 염증성 관절염에 동반된 인지기능장애에서 Lipocalin-2의 역할 및 작용기전

천윤홍

[국가R&D연구보고서] 만성 염증성 관절염에 동반된 인지기능장애에서 Lipocalin-2의 역할 및 작용기전
The role of lipocalin-2 on cognitive dysfunction in patients with chronic inflammatory arthritis 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	경상대학교병원
연구책임자	천윤홍
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-06
과제시작연도	2020
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
연구관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202100014482
과제고유번호	1345314391
사업명	개인기초연구(교육부)(R&D)
DB 구축일자	2021-09-25
키워드	류마티스관절염.인기기능장애.염증성 사이토카인.리포칼린 2.

초록 ▼

□ 연구개요
류마티스 질환 환자의 경우 흔히 동반되는 우울 및 불안과 같은 정서-심리적 문제 외에도, 질병이 진행되면서 다양한 인지기능영역에서 손상이 일어나는 비율이 매우 높은 것으로 일관 되게 보고되어지고 있지만, 류마티스 질환의 인지손상에 영향을 미치는 요인에 관한 연구는 체계적으로 수행되지 못하고 있다. 본 연구에서는 류마티스관절염 활막세포 및 염증세포들에 의해 지속적으로 분비 되어지는 사이토카인, 케모카인, 또는 전신성 염증의 손상관련분자패턴(DAMPs) 인자 등이 혈류를 통하여 뇌-혈관 장벽을 통과해 신경염증을 유발시켜 신경세포와 신경교세포의 손상을 유도하여 인지기능 장애를 유발한다는 joint-brain organ crosstalk의 관점에서 연구하고자 함

□ 연구 목표대비 연구결과
1년차: 류마티스관절염에서 인지기능장애의 동반 양상 및 위험인자의 규명
▶류마티스관절염 환자 대상연구
⦁ 류마티스관절염 및 골관절염(대조군) 환자에서 인지기능장애의 유병률 및 동반양상 분석
⦁ 류마티스관절염 환자에서 인지기능장애의 위험인자 및 질병특성과의 관련성 분석
▶류마티스관절염 동물모델 활용연구
⦁ 콜라겐유도성 관절염 마우스 모델에서 인지기능장애 동반양상 및 질병특성과의 관령성 분석
⦁ K/BxN 관절염 마우스 모델에서 인지기능장애 동반양상 및 질병특성과의 관련성 분석

2년차: 염증성 관절염에 동반된 인지기능장애에서 LCN2의 역할 규명
▶류마티스관절염 환자 대상연구
⦁ 류마티스관절염 및 골관절염(대조군) 환자의 인지기능장애와 LCN2의 관련성 분석 및 류마티스관절염 환자에서 염증성 사이토카인과 LCN2의 관련성 분석
▶류마티스관절염 동물모델 활용연구
⦁ 콜라겐유도성 관절염과 K/BxN 관절염마우스 모델에서 인지기능장애와 염증성 사이토카인과 LCN2의 관련성 연구
⦁ 콜라겐유도성 관절염 및 K/BxN 관절염 마우스 모델의 in vivo 뇌-혈관 장벽(BBB)의 in vivo BBB permeability를 측정하고 인지기능장애와 염증성 사이토카인과 LCN2의 관련성 연구
⦁ 콜라겐유도성 관절염 및 K/BxN 관절염 마우스 모델에서 해마/두정엽/측두엽 조직에서 염증에 따른 신경세포와 신경교세포의 모양변화, 염증성 사이토카인 및 LCN2의 발현양상

3년차: 염증에 의한 인지기능장애 발생시 LCN2의 작용기전 규명
▶LCN2 유전자결핍 마우스를 이용하여 류마티스관절염 동물모델에서 LCN2 유전자가 관절염 및 동반되는 인지기능 장애에 미치는 영향을 관찰
▶신경세포, 신경교세포 세포주 등을 이용한 LCN2에 의한 관절염 및 인지기능 연관 작용기전 규명

□ 연구개발결과의 중요성
▶본 연구는 관절염 마우스 모델의 뇌 해마 부위에서 LCN2의 발현이 증가된다는 결과는 관절염에 의해 지속적으로 발생하는 염증성 사이토카인들이 뇌-혈류 장벽을 통과해 신경세포나 신경 교세포의 LCN2의 발현을 증가시켜 인지기능 장애에 영향을 미친다는 중요한 단서를 제공한 것임.
▶LCN2의 역할 및 작용기전을 중심으로 류마티스관절염에 동반된 인지기능장애의 발생 기전을 최초로 규명하고, 염증에 의한 인지기능장애 발생의 예측인자와 치료타겟으로서의 가능성을 충분히 검증함.
▶류마티스관절염의 치료는 인지기능장애를 개선시키며 류마티스관절염 치료제인 etanercept가 류마티스관절염에 의한 인지기능장애의 예방과 치료제로서의 가능성을 제시함.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구개발의 필요성 ... 4
2) 연구의 가설 ... 4
3) 최종목표 ... 4
4) 연구범위 ... 4
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 5
1) 연구수행내용 ... 5
3. 연구개발결과의 중요성 ... 20
4. 참고문헌 ... 21
5. 연구성과 ... 25
끝페이지 ... 25

표/그림 (16)

표 (A) K/BxN 관절염마우스를 (A) 만성(chronic)과 급성(acute)으로 유도하여 모델 제작. (B) 마우스 관절의 임상적 점수 및 육안 관찰
표 (A) 콜라겐유도성 관절염 마우스에 류마티스관절염 치료제인 Etanercept 투여하여 관절염 초기 치료 마우스(D38) 제작(B) etanercept에 의한 CIA 마우스의 관절 치료 효과(임상적 평가, H&E. SafraninO 염색을 통한 조직학적 평가) (C)CIA 마우스 관절의 초기 치료에 의한 인지기능 개선효과. 왼쪽부터 escape latency, escape target zone, time in target zome, number of the targetzone crossings
표 (A) 콜라겐유도성 관절염 마우스에 류마티스관절염 치료제인 etanercept 투여하여 관절염 후기 치료 마우스(D72) 제작 (B) Etanercept에 의한 CIA 마우스의 관절 치료 효과 (임상적 평가, H&E, SafraninO염색을 통한 조직학적 평가) (C) CIA 마우스 관절의 초기 치료에 의한 인지기능 개 선효과. 왼쪽부터 escape latency, escape target zone, time in target zone, number of the target zone crossings. → Etanercept에 의한 관절치료 및 인지기능 개선효과가 있지만 초기 관절염 치료 보다 효과는 좋지 못함
표 환자의 관절액(synovial fluid)과 혈청을 대상으로 LCN2의 농도를 ELISA를 통하여 확인. 정상 환자 (n=17), 골관절염환자 (n=20), 비활동성 RA관절염환자(n=22), 활동성 관절염환자(n=22) Values are the mean±SEM. *P<0.05, ** P<0.01 versus normal control; ##P<0.01 versus inactive RA patients; $P<0.05, $$P<0.01 versus OA patients
표 CIA마우스의 (A) 관절조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 mRNA 발현 증가 (B) 혈액에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, LCN2의 농도 증가
표 혈액 내 염증성 물질인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 농도 측정. → K/BxN serum에 의해 관절염은 발생하지만 혈액 내 염증성 물질인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 농도변화에는 유의성 없음
표 Etanercept를 투여하여 관절 치료한 CIA 마우스의 (A) 관절조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 mRNA 발현 감소 (B) 혈액에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 농도 감소
표 Etanercept를 투여하여 관절 치료한 CIA 마우스의 (A) 관절조직에서 염증성 사이토카인인 IL-1β는 변화가 없으나, TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 mRNA 발현 감소 (B) 혈액에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2의 농도 감소
표 콜라겐유도성 관절염 마우스(D38)에서 류마티스관절염 치료제인 etanercept로 관절염 치료 후 마우스의 hippocampus에서 뇌-혈관 장벽(BBB) leakgae 억제 효과. IgG의 발현은 확인이 어렵지만 etanercept 치료 후 VEGF의 발현 감소
표 (A) 콜라겐유도성 관절염 마우스의 hippocampus조직에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1 β, LCN2의 protein 발현변화 (B) CIA마우스의 관절조직과 hippocampus에서 LCN2의 발현이 많이 증가된 시 기의 CIA 마우스(D38)의 뇌 내 기억담당부위인 hippocampus와 cortex에서 microglia marker인 Iba-1과 astrocyte marker인 GFAP의 발현 증가(면역조직화학법) (C) 뇌 염증 및 인지기능 관련인자인 Iba-1, GFAP, LCN2, BDNF, APP, p-Tau의 protein 발현변화 관찰 (Iba-1, GFAP, LCN2의 발현은 증가하나 BDNF, APP, p-Tau의 발현은 변화없음. 이 결과 통해 CIA에 의한 인지기능장애는 뇌의 염증인자에 의한 것임을 증명함.)
표 급성 및 만성 K/BxN 관절염 마우스의 hippocampus에서 Iba-1, GFAP의 발현변화는 미미함.→ 콜라겐 유도성 관절염 모델은 adoptive immune system이 주된 경로이고, K/BxN 관절염 마우 스 모델은 innate immune system이 주된 경로라서 두 개의 모델을 사용하고자 계획을 세웠는데, K/BxN 관절염 마우스 모델은 아마도 관절염 발생 기간이 너무 짧아서, 말단의 염증 발생이 중추신 경계인 뇌까지는 영향을 미치지 못한 것이라 생각됨
표 (A) Etanercept를 투여하고 치료한 CIA 마우스의 Hippocampus에서 GFAP와 Iba-1의 발현에 유의성 없음(면역조직화학법) (B) 염증성 사이토카인인 TNF-α, LCN2의 mRNA 발현을 감소시키나 IL-6, IL-1β, Iba-1의 mRNA 발현을 감소시키지는 못 함 (C) NF-κB, COX-2, p-Tau의 protein 발현에 유의성 없음
표 (A) LCN2 유전자 정상 마우스(WT)와 결핍 마우스(KO)에 CIA를 유도 (B) 관절의 임상적 변화와 육안 검사, C57BL/6마우스에 CIA유도 후 관절염 발생 비교 (본 연구실 발표논문) (C) morris water maze를 통한 인지기능검사. escape latency, escape target zone, time in target zone, number of the target zone crossings. (D) Hippocampus에서 Iba-1와 GFAP의 발현 증가 (면역조직화학법, western blot)와 LCN2의 protein 발현은 증가하지만, (E) 혈액 내 LCN2의 농도변화에 영향을 미치지 못함. → CIA를 유도한 LCN2 유전자 정상 및 결핍 마우스의 hippocampus에서 Iba-1, GFAP, LCN2의 발현이 증가되어 있는 것으로 보이나 이 결과는 관절염에 의한 변화라기보다는 CIA 유도시 사용되는 CFA에 의한 변화라 생각됨
표 LCN2 유전자 정상 마우스(WT)와 결핍 마우스(KO)에 K/BxN serum으로 (A) 만성(chronic)과 급성(acute) 관절염을 유도 (B) 관절의 임상적 점수 평가 (C) 혈액 내 염증성 물질인 TNF-α, IL-6, IL-1β, LCN2, BDNF의 농도 변화 (C) K/BxN STA 마우스 모델에서 우울증 행동 이상반응을 측정함. OFT;open field test, FST; forced swimming test, FUST; female urine sniffing test
표 (A) 실험에 사용할 cell line selection. Mouse neuronal cell인 HT-22, human microglia cell인 HMO6#1, #2, #3에서 LCN2, Iba-1, CD68의 endogenous한 protein 발현 확인 (B) HT-22, HMO6#1, #3 cell에 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-⍺의 농도별 time별 처리 후 viability 확인 (C) HT-22 cell에서 H2O2에 의한 자극으로부터 LCN2는 cell viability를 증가시킴
표 (A) 환자에게서 분리한 OA-FLS와 RA-FLS에 염증성 사이토카인인 IL-β, TNF-⍺, LPS를 농도별 처리한 후 culture media내 LCN2의 농도 증가(ELISA)와 (B) mRNA 발현 증가 (F) matrigel을 통한 invasion법에서 rhLCN2 처리에 의한 LCN2의 과발현은 RA환자의 FLS의 invasion을 억제하고 LCN2 KO 마우스 FLS의 invasion 증가 (G) LCN2 WT/KO마우스의 FLS에 염증성 사이토카인인 IL-β, TNF-⍺, LPS를 농도별로 처리하면 LCN2 WT 마우스의 FLS에 비해 KO마우스의 FLS에서 MMP-3, MMP-13의 mRNA의 발현이 증가. 결론적으로 LCN2는 RA-FLS의 invasion 을 억제함을 증명함

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