초록 ▼

□연구개요
조기 재활치료와 뇌졸중 환자의 기능 회복이 보편적으로 양의 상관관계가 있다고 생각되는 바와는 달리, 신경집중치료 시기인 초급성기와 급성기에 실제 손상된 뇌 조직 및 세포에 대한 부유환경의 재활치료 영향이 현재까지도 근거가 충분하지 않은 상태이다. 또한 현재까지 뇌손상 쥐 모델에서 초급성기를 포함하는 시기별 부유 환경에 재활치료를 시작한 시기에 따른 유전자 발현 프로파일링의 변화를 살펴본 연구보고는 없다.
따라서 본 연구의 개발 목적은 최근 개발되어 사용되고 있는 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)을 통해

□연구개요
조기 재활치료와 뇌졸중 환자의 기능 회복이 보편적으로 양의 상관관계가 있다고 생각되는 바와는 달리, 신경집중치료 시기인 초급성기와 급성기에 실제 손상된 뇌 조직 및 세포에 대한 부유환경의 재활치료 영향이 현재까지도 근거가 충분하지 않은 상태이다. 또한 현재까지 뇌손상 쥐 모델에서 초급성기를 포함하는 시기별 부유 환경에 재활치료를 시작한 시기에 따른 유전자 발현 프로파일링의 변화를 살펴본 연구보고는 없다.
따라서 본 연구의 개발 목적은 최근 개발되어 사용되고 있는 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)을 통해서 기존에 알려지지 않은 재활치료환경(enriched environment ; EE) 노출에 의한 허혈성 뇌손상 모델에서 전두엽, 선조체, 해마의 전체 유전자 발현 프로파일링의 변화를 EE 노출 시기를 초급성기(발병 3시간), 급성기(발병 후 3일)로 구분하여 확인하고, 이로써 허혈성 뇌손상 환자에게 시행하는 재활치료와 치료 시작 시기가 어떤 유전자 발현의 변화를 가져올지 알아보고자 하였다.

□연구 목표대비 연구결과
1차년도에는 재활치료환경(EE)이 정상 쥐의 Olfactory bulb에서 유전자 발현에 끼치는 영향을 확인하였다. EE에서, GSH/GSSG 비율이 유의하게 증가하고, iNOS level이 유의하게 감소함을 확인하였다. 본 실험을 통하여 재활치료환경(EE)이 detoxifying and antioxidant enzymes 을 up-regulation시키는 유전자를 발현시킴으로써 ROS와 같은 유해물질로부터 olfactory layer를 보호하는 neuroprotection 기능을 촉진시키는 치료적 역할을 한다는 것을 확인하게 되었다. 연구 결과는 2018년 Frontiers in Neurology지에 게재하였다. 또한 1차년도에는 6주령의 성인 마우스(C57BL/6)에서 한 쪽 경동맥을 묶고 8%의 저산소 chamber에서 hypoxic condition을 30min동안 유지하여 허혈성 뇌손상 동물 모델을 구축하였다.
2차년도에 1차년도에 구축된 허혈성 뇌질환 동물모델에서 발병 후 재활치료 (EE) 시작 시기(초급성기; 발병 후 3시간, 급성기; 발병 후 3일)에 따라 나타나는 운동 및 인지 기능적 변화를 rotarod test, ladder walking test, Y-maze test, open field test, cylinder test, hanging wire test로 행동검사를 시행하여 확인하였다. 초급성기 EE군에서 대조군과 비교하여 Openfield test와 Cylinder test 결과 distance와 rearing 횟수가 유의하게 감소함을 확인하였고, Y-maze test결과 short-term memory의 유의한 향상(alternative behavior percent 향상)이 관찰되었다. Ladder walking test결과 초급성기 EE 노출 후 Slip rate (발이 빠지는 횟수 비율)이 대조군과 비교하였을 때 유의미하게 감소하였다. 이로써 허혈성 뇌손상 후 초급성기 EE노출이 불안을 감소시키고 운동기능과 인지기능을 유의하게 호전시킴을 확인하였다.
3차년도에는 이러한 초급성기 EE노출에 따른 운동 및 인지기능 변화가 어떤 유전자 발현을 나타내는지 알아보고자 Transcriptome을 활용한 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)을 시행하였다. Fold change 2배 이상, p value <0.001로 기준을 설정한 후, KEGG pathway를 분석한 결과, EE군에서 대조군에 비하여 cortex/hippocampus apoptosis pathways에 공통된 9개 유전자(Birc3, Casp8, Pik3cg, Il3ra, Tnfsf10, Fas, Csf2rb, Casp12, Csf2rb2)들의 유의미하게 감소함을 RNA sequencing (transcriptome)으로 확인하였다. 조직학적 검사 및 분자 진단 (Immunohistochemistry) 결과에서도 Apoptotic neuronal cells이 cortex와 hippocampus에서 유의미하게 감소하였다. 유의한 pathway 중 본 연구에서는 FADD 경로(Extrinic apoptotic pathway)를 강조하여 EE에 대한 초급성기 노출의 영향을 연구하였다. Intrinsic과 Extrinsic apoptotic pathway-related genes 의 변화를 규명하기 위하여 본 연구에서 유의한 변화를 보인 4가지 핵심 유전자 (FAS-L, FADD-®, Casp 8, Casp 3)에 대하여 현재 qRT-PCR 및 Western blot을 이용한 정량분석을 진행 중이다. 현재까지 진행한 결과 EE 노출 군에서 apoptotic regulatory gene인 Caspase-3의 mRNA expression이 cortex and hippocampus 에서 유의하게 감소함을 확인하였다. 7월경 나머지 3개 핵심 유전자의 정량 분석 결과가 나올 예정으로, 2020년 하반기에 학술지에 연구 결과를 게재할 예정이다.
결론적으로, 본 연구를 통하여 저산소성 허혈성 뇌손상 후 초급성기 시기에 자발적 운동을 포함한 부유환경을 제공시킨 결과 실험군에서 운동, 인지 기능을 유의하게 호전시키고 불안을 유의하게 감소시켰다. 그 기전으로, 초급성기 부유환경 제공이 뇌 피질과 해마에서 apoptotic pathway 과 관련한 유전자 발현에 작용하는 유의한 효과를 규명하였다.

□연구개발결과의 중요성
본 연구의 참신성(novelty)은 1)저산소성 허혈성 뇌손상 동물 모델에서 초급성기에 자발적 운동을 포함한 부유환경 노출이 미치는 기능적 효과와 그 기전을 뒷받침하는 유전자 발현 프로파일링의 변화를 최초로 살펴보았다는 점과 2) 뇌손상 후 회복 기전에서 기존 연구들은 oxidative stress와 관련한 intrinsic apoptotic pathway를 주로 조명한 반면 본 연구에서는 intrinsic 과 더불어 extrinsic apoptotic pathway에 재활이 미치는 영향을 규명하였다는 점이다.
본 연구 결과는 초조기 가동(very early mobilization)에 대하여 현행 국내외적 임상진료 지침의 생물학적인 이론적 근거 확보하고, 가장 적합한 재활치료 시작 시기를 임상적으로 적용할 수 있는 토대로 중요하다. 특히 뇌손상 발병 후 초급성기 재활치료가 어떤 유전자 발현의 변화를 가져오는지 가늠할 수 있는 기초 자료로 사용할 수 있을 것이며, 더 나아가 유전자 치료의 기술이 발전될 날에는 본 연구에서 확인한 유전자 발현의 변화가 치료의 타겟팅으로 이용될 수 있어 궁극적으로 현행 뇌졸중 치료의 의학기술적 효과를 향상시키고 후유증을 최소화 함으로써 향후 신규발생 장애인들의 삶의 질을 향상시키는데 큰 기여를 할 것이다.

(출처 : 요 약 문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 3
• 1) 연구 목적 ... 3
• 2) 연구 배경 ... 3
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 4
• 1) 1차 년도 ... 4
• 2) 2차 년도 ... 6
• 3) 3차 년도 ... 9
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 16
• 4. 참고문헌 ... 16
• 5. 연구성과 ... 18
• 끝페이지 ... 18