[보고서]바이오프린팅 기반 생체모방 췌도 제작 및 최적화 기술개발

신현정

보고서 정보

주관연구기관

한국과학기술원
Korea Advanced Institute of Science and Technology

연구책임자

신현정

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2020-06

과제시작연도

2020

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

연구관리전문기관

한국연구재단
National Research Foundation of Korea

등록번호

TRKO202100014840

과제고유번호

1711104050

사업명

바이오.의료기술개발(R&D)

DB 구축일자

2021-10-02

키워드

3D 바이오 프린팅.베타세포 클러스터 형성 플랫폼.췌도.당뇨병 치료.베타세포 재생.3D bio-printing.Beta cell clustering platform.Pancreas islet.Anti-diabetic therapy.Beta cell regeneration.

표 다양한 물리적 자극에 따른 세포 활성 유전자 신호전달체계
표 바닥 강성 조절 플랫폼의 모식도 (a) 와 제작 단면도 (b-d)
표 PDMS 바닥과 기존의 plastic dish 간의 hESC 세포의 분화 양상 비교
표 hESC에 분화 약물 처리 전 단계에서 PDMS를 이용한 바닥 강성 조절에 따른 pluripotent marker 발현 정도 비교
표 PDMS 바닥과 plastic 바닥 강성 차이에 따른 hESC의 베타세포로의 분화과정 효율성 검증
표 ECM을 주입하여 3차원 세포 클러스터와 ECM의 지속적인 상호작용을 유도하는 3차원 클러스터 배양환경 조성 기술
표 시간 경과에 따른 3차원 세포 클러스터의 크기 비교
표 3차원 클러스터 내부 세포 밀집 정도 비교
표 ECM이 주입된 3차원 클러스터 환경 속 세포-ECM 관련 단백질 발현 비교
표 고분자 폴리머 증착을 통한 세포배양 표면에너지 조절을 통한 세포의 선별적 클러스터화 개요
표 세포배양 표면에너지의 조절을 위한 다양한 고분자 폴리머 탐색
표 Low-binding petri plastic 플레이트와 pHEMA 코팅된 플레이트 위에서 3일동안 배양된 MIN 6 세포 클러스터의 insulin 과 pdx1 유전자 발현량
표 Low-binding petri plastic 플레이트와 여러 폴리머 박막 코팅 플레이트 위에서 배양한 EC 클러스터의 1일차, 5일차 현미경 이미지
표 Low-binding petri plate와 여러 폴리머 박막 코팅 플레이트 위에서 배양된 EC 클러스터의 1일차 및 5일차 분화관련 유전자 발현량
표 전기 및 전단응력 인가와 바닥 강성 조절이 동시에 가능한 바이오리액터의 개발. (a) 바이오리액터 조립도. (b) 컴솔 프로그램을 통한 바이오리액터 내 전기장 시뮬레이션. (c) 바이오리액터 내 전압 강하 측정 그래프
표 전체 바이오리액터 시스템 구성도. 가운데 세포 배양 구간이 있으며 (a) 2차원 줄기세포의 베타 세포로 분화 중 전기자극 구현이 가능하며 (b) 3차원 베타세포 클러스터와 혈관세포로 이루어진 췌도조직 모사체에 전기자극 구현 또한 가능함
표 콜라겐 기반의 혈관세포형 바이오페이퍼를 몰드에서 분리해낸 모습. (A)몰드에 로딩한 지 (A) 3일과 (B) 7일 후의 몰드로부터 분리된 혈관세포형 바이오페이퍼. Live/dead 염색법으로 확인한 바이오페이퍼 내에서 몰드에서 분리된 지 (C) 3일과 (D) 7일 후 MS-1 혈관세포의 생존성 확인. 흰 화살표는 혈관세포들이 뻗어나가기 전인 콜라겐 구조만 있는 부분을 나타냄. 시간이 지남에 따라, 혈관세포들이 콜라겐을 따라 밧줄이 꼬인 것처럼 타이트하게 그물구조망을 형성하였음. Scale bar = 100 μm
표 HUVEC 세포를 이용한 콜라겐 기반의 혈관세포형 바이오페이퍼. (A) 로딩 직후, (B) 1일 후, (C) 2일 후 몰드 위에서의 콜라겐 기반 바이오페이퍼 모습. (D) 4일 간의 배양 후 몰드에서 분리한 콜라겐 기반 바이오페이퍼의 모습. (E) 액틴 염색(빨강)으로 확인한 바이오페이퍼 내에서 형성된 혈관 구조. 대조 염색으로 세포핵 염색 이용(파랑). Scale bar = (A-C) 100 μm, (D) 1 mm, (E) 200 μm
표 췌장 내 혈관세포가 포함된 베타세포 클러스터를 제작하기 위한 콜라겐 (A, C, E) 혹은 콜라겐–2% 알지네이트 혼합형 (B, D) 바이오페이퍼. 베타세포종(MIN6, 0.8×107 세포/mL)과 혈관내피세포 (MS-1, 0.8×106 세포/mL)의 혼합된 형태로 로딩함. (A, B) 몰드에 로딩한 직후의 형태. (C, D) 7일간 배양한 형태. (E) 몰드에서 분리된 형태. Scale bar = 50 μm
표 콜라겐 기반의 바이오페이퍼 내 혈관세포가 포함된 베타세포 클러스터 형성여부 관찰. 베타세포종(MIN62D1, 1×107 세포/mL)과 혈관내피세포 (MS-1, 1×106 세포/mL)의 혼합된 형태로 배양. (A, C, E) 배양 1일차. (B, D, F) 배양 8일차. (A-B) 명시 야상 (Bright field images). (C-D) MIN62D1의 인슐린 프로모터를 나타내는 형광 사진. (E-F) 인슐린 프로모터(녹색)를 나타내는 MIN62D1 베타세포종과 콜라겐 파이버를 따라 자라는 혈관내피세포. Scale bar = (A-E) 100 μm, (F) 20 μm
표 바이오페이퍼와 미세유체 소자의 결합 과정 모식도
표 바이오페이퍼와 8채널 미세유체 소자의 결합. (A) 바이오페이퍼와 결합된 미세유체 소자의 8개의 채널에 각각 색소를 흘려준 이미지. (B) 형광물질(streptavidin–FITC)을 짝수 채널에만 넣어주어 채널간에 유체 유출 현상이 없는지 확인한 이미지 및 그에 해당하는 정량적 형광신호. 바이오페이퍼에는 형광물질이 결합할 수 있는 폴리스티렌 비드가 내재되어 있음. Scale bar = (B) 1 mm, (C) 500 μm
표 미세유체 소자와 결합된 바이오페이퍼 내 MIN6 세포 염색 여부 관찰. 빨간색과 녹색의 세포염색물질(CellTracker)을 사용함. (A) 40 μl/h의 일정한 유속으로 세포염색물질을 집어넣으면서 염색한 이미지. 차례로 염색물질을 집어넣은 지 5분, 10분, 30분 후의 이미지. (B) 염색 후에 미세유체 소자가 결합된 상태(왼쪽), 미세유체 소자가 제거된 상태(오른쪽). (C) 각각 빨간색(왼쪽)과 초록색(오른쪽) 세포염색물로 염색된 세포 이미지와 그에 해당하는 정량적 형광신호. Scale bar = (A-B) 1 mm, (C) 100 μm
표 미세유체소자를 이용한 바이오페이퍼 내 베타세포 클러스터의 성장 능력 및 단백질 마커 분석. (A) Edu(초록색) 염색을 통한 채널 내 베타세포 클러스터의 성장 능력을 나타내는 이미지. 핵은 파란색으로 염색됨. (B) (A)의 확대된 이미지이며 하나의 베타세포 클러스터 내 세포성장 분포를 나타내는 이미지. (C) 인슐린을 표지하는 항체(초록색)를 통해서 베타세포 클러스터의 정성적 인슐린 분포를 나타내는 이미지. 핵은 파란색으로 염색됨. Scale bar = (A) 500 μm, (B) 100 μm, (C) 50 μm
표 베타세포와 혈관세포를 각각 다른 콜라겐 바이오페이퍼 내에서 배양한 모습. (A) 6 μm 크기의 마이크로 비드를 넣은 콜라겐 바이오페이퍼의 모습. (B) MIN6 세포만 내재된 콜라겐 바이오페이퍼의 모습. (C) MS-1 세포만 내재된 콜라겐 바이오페이퍼의 모습. 모든 사진은 각 클러스터 패턴을 이어주는 연결 패턴을 기준으로 촬영함. Scale bar = 20 μm
표 MIN6 세포의 농도에 따른 다종세포형 베타세포 클러스터의 형성의 차이 관찰. (A) 1×107 cells/ml. (B) 2×107 cells/ml. (C) 3×107 cells/ml. MS-1 세포는 0.5×107 cells/ml의 동일한 농도로 배양함. 모든 사진은 클러스터 패턴을 기준으로 촬영함. Scale bar = 20 μm
표 MS-1 세포의 농도에 따른 다종세포형 베타세포 클러스터의 형성의 차이 관찰. (A) 0.25×107 cells/ml. (B) 0.5×107 cells/ml. (C) 0.75×107 cells/ml. MIN6 세포는 2×107 cells/ml의 동일한 농도로 배양함. Scale bar = 50 μm
표 바이오페이퍼에서 형성된 다종세포형 베타세포 클러스터 내의 MIN6와 MS-1 세포의 형태 및 분포 관찰. (A) 빨간색과 녹색의 세포염색물질(CellTracker)을 사용하여 각각 MIN6와 MS-1 세포를 표지함. (B) (A)와 동일한 자리에서 Hoechst 염색을 통해 본 세포핵의 모습. (C) (A)의 한 클러스터 부분을 확대한 사진. (D) (C)와 동일한 자리에서 본 세포핵의 모습. (E) (B)에서 두 클러스터 패턴을 이어주는 연결 패턴을 확대한 사진. Scale bar = (A,B) 50 μm, (C-E) 20 μm
표 패턴 유무에 따른 바이오페이퍼 내 다종세포형 베타세포 클러스터의 형성 및 인슐린 분비 기능의 차이 관찰. (A) 패턴이 없는 콜라겐 바이오페이퍼 내에서 MIN6 세포와 MS-1 세포를 공배양한 모습. (B) 클러스터 패턴과 이를 이어주는 연결 패턴을 가진 콜라겐 바이오페이퍼 내에서 MIN6 세포와 MS-1 세포를 공배양한 모습. Scale bar = 50 μm
표 다양한 농도의 에탄올을 처리한 다채널 미세유체 소자와 결합된 베타세포 클러스터 바이오페이퍼에서의 세포생존력 분석. Scale bar = 500 μm
표 광학적 방법을 이용한 바이오페이퍼 내의 베타세포 약물 반응 분석. 빛이 세포를 지나면서 달라지는 흡광도의 차이를 이용하여 세포 증식 정도를 관찰하여 분석함. *p<0.5
표 베타세포 클러스터 바이오페이퍼에 SB-204741 약물을 다양한 농도로 처리 후 Live/Dead 분석 키트 처리한 사진과 이를 분석한 그래프. Scale bar = 100 μm
표 베타세포 클러스터 바이오페이퍼에 Streptozotocin (STZ) 약물을 다양한 농도로 처리했을 때의 세포 생존율 확인. 대조군 (DMSO) 을 기준으로 일주일 배양한 베타세포 클러스터에 5 mM와 10 mM의 STZ을 처리한 후의 세포 생존율을 확인함. Scale bar = 100 μm
표 당뇨 환자 결합조직 내 미세환경 정밀 모사 시스템 구축. A. 당화과정을 통한 콜라겐Ⅰ 하이드로겔 내 최종당화산물 축적 유도B. 하이드로겔 내 최종당화산물 축적에 따른 강성도 변화 분석 C. 최종당화산물의 자가형광 특성을 활용한 흡광도 분석
표 콜라겐Ⅰ 하이드로겔 내 최종당화산물-섬유아세포 상호작용 확인. A. 콜라겐Ⅰ 하이드로겔 내 섬유아세포 형태 변화. B. 조직 내 최종당화산물-섬유아세포 상호작용에 따른 관련 단백질 Sirtuin-1 발현 관찰. C. 최종당화산물과의 상호작용에 따른 섬유아세포 내 Sirtuin-1 유전자 및 단백질 발현 정량 비교
표 (A) 하이드로젤 기반 3D 베타세포 클러스터 배양시스템과 결합할 미세 유체 소자의 설계도. (B) 소자와의 결합을 고려한 바이오페이퍼 배양시스템의 디자인 및 미세 패턴 치수. (C) 미세유체 소자와 결합된 베타세포 클러스터 바이오페이퍼의 현미경 이미지. (D) 시트 투과 구역의 채널 내에서 적색 염료의 농도 구배 형성. (E) 이론적 값과 비교하여 바이오페이퍼와의 결합 유무에 따른 미세유체 소자 채널의 농도 프로파일
표 바이오페이퍼 기반 3D 베타세포 클러스터 배양시스템의 마우스 체내 이식 후의 혈당 측정. Sham: 대조군, TP: 이식 (transplantation). 점선표시는 이식 시점을 나타냄. *p<0.5, **p<0.01
표 (A) 면연염색법으로 염색된 MIN6 세포 클러스터의 형광 사진(Scale bar = 20, 100 μm). (B) 세포 배양 조건에 따른 glucose stimulated 인슐린 분비량 비교 분석
표 세포 배양 조건 및 배양 시간에 따른 mRNA 발현량. (A) Vesicle formation과 transcription factors에 관련된 유전자 발현량. (B) Glucose uptake 연관 유전자에 발현량. (*p<0.5, **p<0.01)
표 엑센딘-4에 의한 하이드로젤 배양 시스템 내 베타세포의 증식 차이 분석. (A,B) 엑센딘-4 처리 시간에 따른 상대적 세포 수 변화 관찰 (100 nM). (C,D) 엑센딘-4의 농도에 따른 Edu 발현 세포 비율 관찰. (E) Live/Dead staining 기술을 이용한 시간별 독성 확인
표 클로자핀에 의해 나타나는 하이드로젤 배양 시스템 내 베타세포의 독성 반응 분석. Scale bar = 50 μm
표 SB-204741 약물에 대한 (A-C) 이차원 및 (D-F) 삼차원 바이오페이퍼 환경에서 배양된 베타세포의 반응 비교 분석. (A, D) 세포 수, (B, E) EDU positive 세포의 비율 및 (C, F) MTT assay를 통한 세포 계수 분석 결과. (*p<0.01)
표 바이오프린팅을 이용한 인공 혈관 유사체 제작. (a,b)프린팅 된 인공 혈관 유사 구조체. (c,d)구조체 내의 HUVEC 및 NHDF의 세포생존율 평가
표 섬유아세포의 유무에 따른 미세혈관형성 영향. 섬유아세포가 존재할 시 패터닝된 혈관으로부터 신생혈관 형성이 유도됨을 확인함
표 혈관 유사체 내 세포 농도에 따른 세포 생존율 변화 (n=3)
표 제작된 혈관 유사체 내의 신생혈관 형성 시계열 (time-series) 이미지
표 fibrinogen 지지체 농도에 따른 신생혈관 형성 변화. 농도가 낮을 때 섬유아세포가 없는 방향으로도 혈관이 형성되지만, 높을 때에는 섬유아세포 방향으로만 혈관형성이 유도됨
표 Min6 포함된 피브린 젤과 PCL 하이브리드 프린팅 경로
표 PCL 구조체의 압축시험 결과 (a) 프린팅 속도 변화에 따른 압축응력 (Compressive stress) - 압축 변형 (Compressive strain) 그래프, (b) 프린팅 속도에 따른 압축 모듈러스
표 피브린 농도에 따른 세포 분포 양상. 피브린 농도가 (a) 6mg/ml, (b) 8mg/ml, (c) 10mg/ml 로 높아질수록 세포가 누수되는 현상이 줄어듦. * = Min6가 포함된 피브린 하이드로젤. Scale bar = 100μm
표 하이브리드 프린트된 베타세포 복합 구조체. (a-d) Min6 가 포함된 구조체 현미경 사진 (e) 구조체 내 Min6 Live & dead assay 형광 이미지, Green = live cells, Red = dead cells. Scale bar = (a-b) 500 μm, (c-e) 200um
표 이식형 구조체 내 Min6 생존률 및 증식률 평가. (a) Day 1, Day 3 Min6생존률, (b) Min6 증식에 따른 형광강도 변화
표 복합 구조체 내 Min6의 insulin 분비 평가
표 저농도 피브린젤 (Bridge gel)을 이용한 미세혈관 패터닝 공정 및 프린팅 결과. (a) 미세혈관 구조체 프린팅 전략, (b) 가교 전후 프린팅 결과물 사진, (c) 프린팅 후 구조체 내의 세포 생존율
표 3D 바이오 프린팅 공정을 통해 형성된 미세혈관 이미지. (a) 프린팅 구조체 구상도, (b) 형성된 미세혈관의 날짜별 이미지, (c) 프린팅 9일 후 양쪽 채널에서 뻗어난 미세혈관이 서로 연결됨, (d) 형성된 미세혈관이 관 구조를 이루고 있음을 확인함, (e) 혈관 내피세포 채널에 형광을 띄는 마이크로비드를 주입한 결과 이미지. (green: GFP-HUVEC, yellow: 1μm microbeads)
표 Bridge gel 패터닝 조절을 통해 형성된 다양한 패턴의 미세혈관 네트워크 이미지. (a) 대각 패턴의 프린팅 구조체 구상도와 형성된 미세혈관 이미지. (b) 물결 패턴의 프린팅 구조체 구상도와 형성된 미세혈관 이미지. (c) 네갈래의 가지 패턴의 프린팅 구조체 구상도와 형성된 미세혈관 이미지
표 베타세포 스페로이드 형성이 유도되는 이식형 구조체 제작. (a) 구조체 제작을 위한 하이브리드 프린팅 전략. (b) 니들 노즐을 활용한 고농도 세포 페터닝. (c),(d) 프린팅된 구조체 이미지. ((c) 윗면, (d) 측면)
표 바이오잉크 의 토출시간에 따른 3D 구조체 내 베타세포 스페로이드 크기 조절. (a) 토출시간이 늘어남에 따라 베타세포 스페로이드 크기 증가. (b) 토출시간에 따른 3D 구조체 내 스페로이드 분포의 날짜별 이미지. (c) 구조체의 Live & assay 날짜별 이미지 사진 (green : live red : dead)
표 미세혈관 네트워크 구조체 프린팅 공정을 활용하여 혈관 구조 유사체가 포함된 베타세포의 3D 배양 (점선 : 알지네이트 기반 바이오잉크가 분해된 부분, green: GFP-HUVEC, red: insulin, blue: hoechst 화살표 : 양쪽에서 유도 된 미세혈관 구조가 연결된 모습)
표 In-situ 스페로이드 형성을 유도하는 프린팅 공정 도식과 바이오 잉크 토출 분석. (A) 공정과정 도식. (B) 젤라틴 농도에 따른 알지네이트 기반 바이오 잉크와 희생 바이오 잉크의 점성. (C) 알지네이트 기반 바이오 잉크의 젤라틴 농도에 따른 토출된 형광 비드의 이미지와 강도 분포 (스케일바, 200 μm)
표 세포 스페로이드의 크기 조절 및 거리 조절. (A) 세포가 포함되는 희생 바이오잉크의 토출 시간에 따른 형성되는 스페로이드의 지름. (B) 토출 시간에 따른 형성된 스페로이드의 진원도. (C) 프린팅 경로에 따라 형성된 스페로이드의 현미경 이미지 (스케일바, 200 μm). (D) 스페로이드 거리조절에 따른 스페로이드 표면간 거리
표 스페로이드 패터닝 공정의 활용. (A) 다종세포를 이용한 스페로이드 패터닝 (스케일바, 200 μm). (B) CAD/CAM 소프트웨워를 이용하여 제작한 스페로이드가 패터닝된 삼차원 나선 구조체 (스케일바, 200 μm)
표 세포 독성 검사를 위한 베타세포 스페로이드 프린팅 구조체 제작. (A) 베타세포 스페로이드가 배치된 구조체 디자인과 프린팅 후 24웰에서 배양. (B) 에탄올 처리 농도에 따른 구조체 내의 베타세포 Live and dead assay 이미지 (스케일바, 200 μm). (C) 에탄올 처리 농도에 따른 베타세포의 물질 대사능력 비교
표 스페로이드 바이오 프린팅 기술의 생체 적합성 확인
표 바이오 잉크 구성과 토출 변수에 의한 프린팅 결과. Scale bar = 200 μm

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