초록 ▼

□ 연구개요
● 본 연구는 GRAS(Generally Regarded As Safe)로 분류된 Kluyveromyces lactis 효모의 대사 과정을 재설계함으로써 HMO(Human Milk Oligosaccharides)의 약 35%를 차지하는 기능성 식품 소재인 2’-fucosyllactose의 고생산성 생산방법의 구축을 목표로 함.
● 기존의 대사공학적으로 구축된 E. coli를 이용한 2’-FL의 생산방식은 plasmid가 도입된 균주의 선별적 배양을 위한 항생제의 사용, 효소의 과발현을 위한 IPTG induc

□ 연구개요
● 본 연구는 GRAS(Generally Regarded As Safe)로 분류된 Kluyveromyces lactis 효모의 대사 과정을 재설계함으로써 HMO(Human Milk Oligosaccharides)의 약 35%를 차지하는 기능성 식품 소재인 2’-fucosyllactose의 고생산성 생산방법의 구축을 목표로 함.
● 기존의 대사공학적으로 구축된 E. coli를 이용한 2’-FL의 생산방식은 plasmid가 도입된 균주의 선별적 배양을 위한 항생제의 사용, 효소의 과발현을 위한 IPTG induction 과정, endotoxin 제거 등 복잡한 정제 과정 및 L-fucose와 같은 고가의 기질 이용 등의 문제점이 있음. 따라서 이러한 문제를 해결하며 고효율 생물공정을 개발코자 함.

□ 연구 목표대비 연구결과
1) 목적 효소 유전자의 발굴 및 codon-optimization
- E. coli와 A. thaliana 유래 GMD와 GMER 효소의 유전자(E. coli 유래 gmd와 wcaG, A. thaliana 유래 MUR1과 GER1), H. pylori 유래 FucT2, B. fragilis 유래 WcfB 효소 유전자(fucT2와 wcfB)의 서열 정보를 NCBI, UniProt 등의 database를 이용하여 확보하였으며, 원활한 발현을 위하여 codon-optimization을 수행.
2) Expression vector system의 구축
- 각각의 codon-optimization이 완료된 7종의 유전자(E. coli 유래 gmd와 wcaG, A. thaliana 유래 MUR1과 GER1, H. pylori 유래 2종의 fucT2, B. fragilis 유래 wcfB)를 pKLAC2 vector에 도입하여, 목적 효소 단백질이 세포 밖으로 분비되지 않고 cytosol 내에서 발현될 수 있는 expression vector를 구축함.
3) K. lactis의 lactose 대사 확인
- 40 g/L의 lactose가 포함된 YPD 배지에 K. lactis를 배양하여 lactose의 소모 확인. Glucose와 lactose가 동시에 24h 내에 모두 소모됨을 확인함.
4) Yeast transformation을 통한 K. lactis 균주의 구축
- E. coli 유래의 gmd와 wcaG, H. pylori 유래의 fucT2 조합, A. thaliana 유래의 MUR1과 GER, fucT2 조합으로 구성된 expression vector를 활용하여 K. lactis에 yeast transformation을 수행하여 균주를 구축함.
5) LC/MS를 통한 유제품(우유) 성분 확인
- 우유의 lactose 함량을 낮춤과 동시에 기능성 2’-FL을 생산을 위해, 잠재적 성장 저해물질 및 기능성 물질을 파악하고자 LC/MS 분석을 수행하였고, 18종의 단백질 signature peptide 확인.

□ 연구개발결과의 중요성
● 본 연구과제를 통해 세계 최초로 구축하게 될 2’-FL의 고효율 생산이 가능한 K. lactis 균주는 기능성 분유 및 각종 기능성 식품의 제조에 활용이 가능함.
● K. lactis 균주는 외래 단백질 발현에 주로 이용되어 옴. 본 연구를 통하여 수행될 K. lactis 균주의 대사과정 engineering 기반 기술이 활용되면 lactose 기반의 3’-FL, 2’-SL (Sialyllactose), 3’-SL 등의 다양한 HMO의 생산에 적용할 수 있음.
● 구축된 균주는 산업적으로 2’-FL의 생산에 이용될 수 있어 경제적 파급 효과가 클 뿐만 아니라, K. lactis 균주의 대사과정 engineering의 발전에도 기여할 수 있을 것으로 생각됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 가. 최종목표 ... 4
• 나. 연구의 필요성 ... 4
• 다. 연구가설 ... 5
• 라. 연구범위 ... 5
• 2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 6
• 가. 목적 효소 유전자의 발굴 및 codon-optimization ... 6
• 나. Expression vector system의 구축 ... 7
• 다. K. lactis의 lactose 대사 확인 ... 7
• 라. Yeast transformation을 통한 K. lactis 균주의 구축 ... 8
• 마. LC/MS를 통한 유제품(우유) 성분 확인 ... 8
• 3. 연구개발결과의 중요성 ... 9
• 4. 참고문헌 ... 9
• 5. 연구성과 ... 9
• 끝페이지 ... 9