초록 ▼

□ 연구개요
CRISPR를 이용한 유전자 편집 기술은 뛰어난 편의성 및 확장성으로 인해 생물학 연구의 다양한 분야에서 폭넓게 활용되고 있음. 본 연구에서는 CRISPR 유전자 편집 기술을 이용하여 면역세포 치료제의 항암 효능을 향상시키는 탐색연구를 수행함. CRISPR를 통한 위치 특이적 knock-in 실험을 통해 T 세포의 세포 독성에 있어 중요한 요소인 granzyme B 효소에 형광 단백질을 표지하였음. 향후 본 연구를 통해 제시된 payload 엔지니어링을 통해 키메라항원 수용체 T 세포 치료제에 대한 독성 저항성을

□ 연구개요
CRISPR를 이용한 유전자 편집 기술은 뛰어난 편의성 및 확장성으로 인해 생물학 연구의 다양한 분야에서 폭넓게 활용되고 있음. 본 연구에서는 CRISPR 유전자 편집 기술을 이용하여 면역세포 치료제의 항암 효능을 향상시키는 탐색연구를 수행함. CRISPR를 통한 위치 특이적 knock-in 실험을 통해 T 세포의 세포 독성에 있어 중요한 요소인 granzyme B 효소에 형광 단백질을 표지하였음. 향후 본 연구를 통해 제시된 payload 엔지니어링을 통해 키메라항원 수용체 T 세포 치료제에 대한 독성 저항성을 보이는 세포에 대해 향상된 항암 효능을 획득할 것으로 기대됨.

□ 연구 목표대비 연구결과
연구 목표: CRISPR를 통한 위치 특이적 knock-in 방법론 탐색 및 T 세포 내재적 유전자 조작의 효율 검증
■ 세부 목표 1 (1년차) : 바이러스 및 비바이러스 기반 CAR 유전자 전달 기법 비교 분석
- TRAC locus를 표적하는 gRNA의 디자인 및 NGS를 이용한 knock-out 효율 분석
- CRISPR knock-in 조건 최적화 및 공여 벡터에 종류 따른 생존율 및 FACS와 western blot analysis 를 이용한 KI 효율 분석
- AAV 바이러스를 이용한 donor DNA 전달 및 knock-in 효율 최적화

■ 세부 목표 2 (2년차) : 위치특이적 Granzyme B 유전자 편집 기법 확립
- Granzyme B의 intron에 고효율 DSB를 유도하는 gRNA 선정
- Granzyme B-mcherry 퓨전 단백질 제작을 위한 AAV 제작
- Granzyme B-mcherry를 발현하는 T 세포의 형질 및 세포독성 분석

□ 연구발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
○ Granzyme B의 CRISPR 방법을 통해 T 세포의 활성화에 의존적으로 표적세포에 원하는 payload를 전달하는 신기술 확립

○ 새롭게 엔지니어드된 granzyme B는 내재적인 secretory pathway를 통해 발현되어 cycotoxic granule안으로 이동하므로, 다양한 독성 단백질들을 T 세포에게 위해함 없이 fusion 하는 것이 가능함.

○ 이를통해 T 세포의 세포 독성 메커니즘에 대해 저항성을 갖는 암세포의 사멸을 유도하는 효과적인 toxic payload를 디자인하여 탑재함

○ 고형암 내에 존재하는 다양한 돌연변이 중 T 세포의 독성 메커니즘에 대해 저항성을 갖는 종류 (e.g. FASR, FADD등)에 대해서도 효과적인 사멸을 유도하는 치료제 개발에 응용 가능함

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• 2.1 Granzyme B 표적 고효율 gRNA 디자인 ... 5
• 2.2 Homology-directed repair (HDR)을 위한 공여 AAV 디자인 및 KI 실험 ... 7
• 2.3 CRISPR/Cas9을 이용한 인간 T 세포의 표적 유전자 Knock-out 분석 ... 10
• 2.4 플라스미드와 AAV를 이용한 Knock-in 효율 비교 ... 11
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 13
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 13
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 13
• 3) 목표 달성 수준 ... 14
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 14
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 14
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 14
• 6. 참고문헌 ... 15
• [붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 16
• [붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 17
• 끝페이지 ... 19