[보고서]인간 질환 특이적 역분화줄기세포를 이용한 신약 스크리닝 2D/3D 플랫폼 기술 개발

한용만

보고서 정보

주관연구기관

한국과학기술원
Korea Advanced Institute of Science and Technology

연구책임자

한용만

참여연구자

이범희 , 위갑인

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2019-06

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202100018982

DB 구축일자

2022-03-12

키워드

고효율·대량 스크리닝.역분화줄기세포.질환특이적.RAS 질환군.3차원 오가노이드.High-throughput screening.Induced pluripotent stem cells.Disease-specific.RASopathy.3D organoid.

표 CFC 증후군 조골세포 분화 7일째 나타나는 RUNX2와 OPN 단백질 발현 이상
표 CFC 증후군 조골세포에서 나타나는 TGF-beta 및 ERK 신호전달체계의 과활성화
표 정상 대조군 조골세포에서 확인한 TGF-beta와 ERK 신호전달체계의 관련성
표 조골세포에서 U0126과 SB431542를 처리하여 TGF-beta와 ERK 신호전달체계의 관련성 확인
표 CFC 증후군 조골세포에서 BMP 신호전달체계 저하 현상 확인
표 정상 대조군 조골세포에 Activin A와 LDN193189를 처리함으로써 TGF-beta와 BMP 신호전달체계의 관련성 확인
표 조골세포에 SB431542를 처리하여 TGF-beta와 BMP 신호전달체계의 관련성 확인
표 정상 대조군 조골세포 분화 과정에서 ERK, TGF-beta, BMP 신호전달체계를 조절하여 CFC 증후군 조골세포의 표현형 재현 확인
표 CFC 증후군 조골세포 분화 과정에서 ERK, TGF-beta, BMP 신호전달체계 조절을 통해 ALP 효소활성 증가 및 골미네랄 침착 능력 회복
표 CFC 증후군 조골세포 분화 과정에서 ERK, TGF-beta, BMP 신호전달체계 조절을 통한 마커 유전자 발현 일부 개선
표 새롭게 공여 받은 CFC 증후군 환자 2명의 임상 정보
표 신규 CFC 증후군 환자 유래 역분화 줄기세포로부터 분화한 조골세포의 이상 확인
표 누난 증후군 환자 유래 신경세포 분화과정에서 PHPS1 및 U0126 처리
표 누난 증후군 환자 유래 신경세포에서 수상돌기와 축삭돌기의 길이 감소
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 SHP2와 ERK의 활성 증가
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 Tau-1 단백질 발현 및 p-CREB 활성 증가
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 신경교세포의 비율 증가
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 GFAP 단백질의 증가
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 CD44 표면 마커 비율 증가
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 SHP2 억제제 처리에 의한 CD44 표면마커 비율 감소
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 SHP2 억제제 처리에 의한 수상돌기 길이의 회복
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 SHP2 억제제 처리에 의한 축색돌기 길이의 회복
표 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포에서 SHP2 억제제 처리에 의한 Tau-1 단백질과 p-CREB 활성 조절
표 SHP2 억제제 처리에 의한 누난 증후군 환자 유래 신경계 세포의 세포 외 활성 감소의 부분적 향상
표 역분화 줄기세포를 이용한 대뇌 오가노이드로의 분화 방법
표 역분화 줄기세포에서 대뇌 오가노이드로의 분화 과정에서 보이는 형태학적 특징
표 대뇌 오가노이드로의 분화 25일째에 신경 외배엽 마커의 정상적인 발현
표 대뇌 오가노이드로의 분화 56일째에 신경 외배엽 및 신경세포 마커의 발현 확인
표 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 신경교세포 특이적 마커 발현의 증가
표 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 CD44 표면 마커를 갖는 세포의 비율 증가
표 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 Olig2 마커를 이용해 희돌기교세포전구체의 분화 여부 확인
표 SHP2 억제제를 처리한 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 신경교세포의 감소
표 SHP2 억제제를 처리한 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 CD44 표면 마커의 유의미한 감소
표 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 다양한 피질층 발달 결함 확인
표 SHP2 억제제 처리로 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 TBR1 발현 향상
표 SHP2 억제제 처리로 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 SATB2 발현 향상
표 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 세포 외 활성 신호의 측정 (55일)
표 SHP2 억제제 처리를 통해 누난 증후군 환자 유래 대뇌 오가노이드에서 세포 외 활성 신호의 부분적인 개선 효과 (62일)
표 코스텔로 환자 유래 인간 역분화 줄기세포에서 중간엽 줄기세포의 특성분석을 위한 세표 표면 단백질 발현 분석
표 골아세포의 성숙도 평가를 위한 ALP 염색 및 Alizarin red 염색 결과
표 웨스턴 블롯을 통한 코스텔로 환자 중배엽 줄기세포에서의 HRAS-GTP 파악
표 Real-time PCR을 통한 코스텔로 환자 중배엽 줄기세포에서의 세포외 기저물질 관련 유전자 발현 비교
표 웨스턴 블롯을 통한 코스텔로 환자 중배엽 줄기세포에서의 ERK 활성도 및 기저물질 관련 유전자 발현 비교
표 골형성 중의 코스텔로 환자 중배엽 줄기세포에서의 ERK 및 TGF-beta 신호전달체계 활성화 분석 및 RUNX2와 RUNX2 하위 인자들, 세포외 기저물질 발현도 조사
표 골형성 중 환자 중배엽 줄기세포에 SB431542(TGF-beta 신호전달 억제제) 처리를 통한 일부 ALP 회복
표 파브리병환자에서 보이는 혈관병증 신호전달체계 확인
표 파브리병 환자에서 TGF-beta 신호전달체계 확인
표 파브리병 환자에서 보이는 TSP1의 이상 발현
표 정상의 혈관내피세포에 LYSO-GB3를 처리하였을 때 나타나는 형태학적 변화
표 정상의 혈관내피세포에 LYSO-GB3를 처리하였을 때 혈관병증 관련 신호전달체계의 RNA 발현량 변화
표 정상의 혈관내피세포에 LYSO-GB3를 처리하였을 때 나타나는 혈관병증 신호전달체계 변화
표 정상의 혈관내피세포에 LYSO-GB3를 처리하였을 때 나타나는 TSP1의 위치 확인
표 브리병의 치료를 위해 화합물을 처리하였을 때 나타나는 형태학적 변화
표 약물 처리 후 혈관병증의 호전 확인
표 화합물 처리 후 신생혈관능력 확인
표 대조군과 파브리병 환자 특이적 역분화 줄기세포에서의 전분화능 마커의 발현
표 파브리병 환자 특이적 역분화 줄기세포에서 GLA 유전자의 돌연변이 확인
표 심장근세포 특이적 근절 단백질인 α-actinin을 이용한 심장근세포로의 분화 효율 확인
표 역분화줄기세포에서 분화한 심장근세포에서의 심장 특이적 근절 단백질 발현 및 Gb3의 축적
표 역분화 줄기세포에서 분화한 심장근세포의 크기 측정
표 CRISPR-Cas9 시스템을 활용한 OptoSTIM1 E281A A9 및 유전자 재조합 칼슘 센서 GCaMP6f-dTomato 인간 배아줄기세포주 확립
표 신경로제트 세포내 칼슘 이온 농도 변화 관찰
표 단일 세포층 방식의 신경전구세포 분화 프로토콜 개요
표 단일 세포층 방식의 프로토콜을 활용한 신경전구세포 분화과정 중 단계 특이적으로 발현되는 분화 마커의 단백질 발현 양상 확인
표 단일 세포층 방식의 프로토콜을 활용한 신경전구세포 분화과정 중 단계 특이적으로 발현되는 분화 마커의 mRNA 발현 양상 확인 및 기존 분화 프로토콜과의 대조
표 신경전구세포 분화 단계상에서의 칼슘 신호전달계 관련 유전자 발현 양상 확인
표 NFATc1 전사인자 유래 RFP계열 형광 바이오센서 리포터 (NFATc1-FuRED) 의 과발현을 위한 렌티바이러스 제작
표 광 자극을 통하여 유도된 NFATc1 전사인자의 이동
표 연속적 광 자극을 통하여 유도된 NFATc1 전사인자의 가역적 이동
표 NFAT 전사인자의 전사 활성도 측정
표 LED array의 광도에 따른 NFATc1 전사인자의 이동 활성
표 선정된 광자극조건상에서의 CREB 신호전달계 활성도
표 선정된 광자극 조건을 통한 신경전구세포의 증식 표현형 변화 유도 및 관찰
표 선정된 광자극 조건을 통한 신경전구세포 분화 과정중의 분화 양상 표현형 변화 유도 및 관찰
표 CFC 환자 유래 인간 역분화줄기세포에서 간 내배엽 전구세포로의 분화
표 CFC 환자 유래 인간역분화줄기세포의 단일세포 단위 배양시 줄기세포 특이적 단백질 발현
표 간 내배엽 전구세포에서의 전구세포 특이적 단백질과 줄기세포 특이적 단백질 발현 확인
표 3D 간 오가노이드를 위한 CFC 환자 유래 역분화줄기세포를 이용한 중간엽줄기세포로의 분화
표 CFC 환자 유래 중간엽줄기세포의 분화 효율 확인
표 공배양 형태를 통한 3D 간 오가노이드 형성 과정
표 시간에 따른 간 오가노이드의 3D 형태
표 3D 간 오가노이드의 조직 단면
표 3D 간 오가노이드 조직 단면의 각 세포 특이적 단백질 발현
표 3D 간 오가노이드 조직 단면의 간세포 특이적 단백질 발현
표 부유배양을 통한 3D 간세포 분화 과정
표 3D 간세포 분화과정 중의 세포 형태
표 sh-RNA ARID2 처리한 세포에서 FGF 처리 후 AKT, mTOR pathway의 활성도 변화
표 Arid2+/- 마우스 제작을 위해 ARID2 exon1을 표적하여 Arid2의 exon1에 8bp의 deletion이 존재하는 C57BL/6N 마우스를 제작함
표 ARID2와 Ras-MAPK pathway의 연관성 검증
표 환자의 섬유아세포에서 RAS-GTP가 항진되어 있음을 발견하여, ARID2와 Ras-MAPK pathway의 연관성을 검증
표 환자의 역분화 줄기세포 확립 후 신경세포로의 분화 유도
표 3,6,9,12개월 연령의 윌슨병 마우스의 생화학적 분석.A. Aspartate aminotransferase, B. Alanine aminotransferase, C. Albumin, D. Total bilirubin, E. Direct bilirubin * P<0.05
표 Atp7b+/+와 Atp7b-/- 쥐들에서 뇌와 간조직에서 구리/철/메티오닌 대사물질 농도 비교 A. 간조직, B. 뇌조직 * P<0.05
표 12개월령 Atp7b-/-와 Atp7b+/+ 마우스에서 행동 및 운동시험 비교, 월령에 따른 Atp7b-/-와 Atp7b+/+쥐에서 행동 및 운동시험 비교 A. Tail suspension test, B. Rota-rod test, C. Open field test-Total distance, D. Open field test-Time in periphery, E. Water maze test-Total distance, F. Water maze test-Latency to target. * P<0.05
표 한국인 씨트린 결핍증 환자의 임상적 유전학적 특성의 보고, Journal of Human Genetics (2017) 62, 305–3075
표 한국인 Rasopathy에서의 심장 질환의 특성 보고, Pediatr Cardiol (2016) 37:1539–1547
표 파브리병에서 중증 위장관 출혈의 보고, Medicine (2017) 96:6
표 파브리병 환자의 치료전 신조직에서 병리학적 소견의 정리
표 파브리병 환자의 신조직에서 보체의 침착이 발견됨을 분석
표 파브리 마우스와 정상 마우스간의 혈장에서 iC3b의 발현양의 비교
표 간질환으로 발병한 윌슨병 환자에 비해 신경학적 증상으로 발현한 윌슨병 환자가 구리 대사 관련 물질의 농도가 더 낮음을 확인
표 암브록솔 농도가 올라갈 수로 효소 (GBA, glucocerebrosidase)의 잔존능이 향상됨 (Journal of Medical Genetics 2019 in revision)
표 암브록솔 농도가 올라갈 수로 환자 체세포의 효소 (GBA, glucocerebrosidase)의 잔존능이 향상됨 (Journal of Medical Genetics 2019 in revision)
표 환자의 체세포에서 암브록솔 처리 후 GBA의 라이소좀으로의 분포 분석
표 암브록솔 증량에 따라 혈장 및 뇌척수액의 암브록솔 농도가 증가되었으며, 효소능의 점차적인 증가를 보임 (Journal of Medical Genetics 2019 in revision)
표 암브록솔 치료 후 헤모글로빈, 혈소판 및 angiotensin-converting enzyme의 변화상 큰 차이는 없었음
표 4.5년 고용량 암브록솔 투여 후 고셔병의 신경학적 증상 점수 (modified severity scoring tool, mSST)의 변화를 분석
표 4.5년 고용량 암브록솔 투여 후 환자들의 일상 생활 능력 점수 (Korean version of Barthel index, K-MBI)의 변화를 분석
표 4.5년 고용량 암브록솔 투여 후 경련의 빈도가 뚜렷하게 감소함을 볼 수 있음
표 4.5년 고용량 암브록솔 투여 후 인지 능력의 저하의 악화의 진행이 없음을 볼 수 있음
표 4.5년 고용량 암브록솔 투여 후 Brain MR spectroscopy 상 뇌손상의 지표는 큰 변화가 없음을 확인 할 수 있음
표 암브록솔 농다가 감소함에 따라 혈장의 lyso-Gb1이 감소함을 확인할 수 있음
표 암브록솔 투약한 환자들과 암브록솔 투약을 받지 않고 있는 고셔병 환자들의 lyso-Gb1을 비교
표 환자별 암브록솔 농도의 차이 조사
표 신경섬유종증 1형 환자에서 게놈 DNA 기반의 장 PCR 프라이머를 이용하여 높은 진단률을 달성
표 총 271명의 환자에서 높은 진단률을 보임. 본 연구 결과를 국내 특허 등록 및 해외 특허 출원 함
표 신경섬유종증 1형 환자에서 Ras-GTP와 ERK의 인산화의 증가
표 5명의 환자 중 후보 약물 (drug)을 처리하였을 때 2명 (PT3, PT4) 환자만 반응을 보임
표 Naphthol AS-BI phosphate를 이용한 ALP 활성 회복 측정. 왼쪽은 현미경 사진, 오른쪽은 620 nm 파장에서 측정한 흡광도
표 자동화 플랫폼을 활용한 Naphthol AS-BI phosphate를 기반으로 한 파일럿 스크리닝
표 384 플레이트 ALP 효소활성 assay 염 용해 테스트
표 pNPP 어세이를 통해 ALP 활성 회복 측정
표 pNPP 어세이를 이용한 분화 골아세포의 ALP 활성 측정의 실험 내 편차, 재현성 확인. A, 동일 실험 내 well 간 편차 확인. B, 동일 실험 내 well 및 플레이트 간 편차 확인
표 각각의 플레이트의 pNPP 어세이 결과의 요약. DMSO 음성 대조군, SB431542 양성 대조군, 전체 약물 평균, wild type의 405 nm에서의 흡광도 측정치
표 1차 스크린의 106개 후보를 이용 (왼쪽) 한 2차 스크린 결과 (오른쪽)
표 CFC 대조군 대비 MS275, SB, Trifluridine 처리 시 증가한 유전자들 분석
표 정상 대조군과 각각의 약물을 처리한 CFC에서 대조군에 비해 공통적으로 증가되어 있는 유전자들 분석결과
표 WT과 MS275를 처리한 CFC에서 공통적으로 증가된 유전자들의 GSEA 분석 결과
표 Wnt 신호회로에 속하는 유전자들의 qRT-PCR 결과
표 Wnt 및 RAS 신호회로에 속하는 유전자의 WB 결과
표 WT 및 CFC에 후보물질들을 약물 처리한 상태에서의 골분화 유전자 변화 (qRT-PCR)
표 CFC 대조군 대비 WT과 MS275 처리 환자 세포에서 동시에 증가되거나 저해된 신호회로 (IPA 결과)
표 WT과 약물 후보 물질 처리한 CFC에서의 p53 신호회로 유전자 발현량 (qRT-PCR 결과)
표 WT과 CFC 환자에 HDAC 억제제를 처리한 뒤의 ALP 염색 결과
표 역분화 줄기세포 유래 중간엽줄기세포의 조골세포로의 분화 정량화
표 역분화 줄기세포 유래 중간엽줄기세포의 384-well plate에서의 siRNA 트랜스팩션 조건 확립
표 정상 및 CFC MSC의 분화 전후 유전자 발현 프로파일
표 CFC MSC에서 발현이 크게 변화된 유전자 리스트
표 CFC MSC에서 발현이 크게 증가(A) 또는 감소된(B)유전자
표 1차 siRNA 라이브러리 스크리닝 결과
표 1차 라이브러리 스크리닝 hit 대표 이미지
표 1차 siRNA 라이브러리 스크리닝 hit
표 STK19 knockdown이 마커 유전자 발현에 영향을 미치지 않았음을 보여주는 결과
표 STK19 유전자 knockdown에 의한 조골분화 부분적 회복
표 발굴된 5가지 인산화 효소 knockdown 독성 비교
표 두 번째 siRNA 라이브러리 스크리닝 결과
표 CDKN1C 및 RB1 유전자 knockdown에 의한 CFC MSC 조골분화능 회복
표 CFC MSC에서의 Cyclin-dependent kinase inhibitor 유전자군 발현양상
표 조골세포 분화 관련 전사조절 인자 발현 (RNA-seq FPKM 값)
표 CFC MSC의 RNX2, PPAR-γ 유전자 발현양상
표 Pro-inflammatory cytokine/chemokine 발현 (RNA-seq FPKM 값)

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