[보고서]간섬유화 바탕에서 발생하는 간암의 발암 및 진행 과정에서 NADPH Oxidase 1 및 4 상동체가 종양미세환경에 미치는 차별적 역할과 분자기전 규명

백용한

간섬유화 바탕에서 발생하는 간암의 발암 및 진행 과정에서 NADPH Oxidase 1 및 4 상동체가 종양미세환경에 미치는 차별적 역할과 분자기전 규명
Investigation of the differential role of NADPH oxidase 1 & 4 isoforms on tumor microenvironment in the development and progression of hepatocellular carcinoma arising from fibrotic liver 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	성균관대학교 SungKyunKwan University
연구책임자	백용한
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2020-03
과제시작연도	2019
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
등록번호	TRKO202100019720
과제고유번호	1711090494
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-03-19
키워드	간섬유화.간경변증.간암.종양미세환경.대식세포.간성상세포.간암치료제.NADPH oxidase 1.NADPH oxidase 4.

초록 ▼

□ 연구개요
간섬유화 (hepatic fibrosis)는 간손상에 대한 간내의 상처회복반응의 일환으로서 방생되며 만성적인 간손상은 간섬유화를 거쳐 간경변증 (liver cirrhosis)으로 진행되고, 결과적으로 여러가지 심각한 합병증들과 간세포암 (hepatocellular carcinoma; HCC)을 발생시켜 예후가 매우 불량함. 간섬유화 및 간세포암 발생과정에서 NADPH oxidase (NOX) 매개 산화스트레스가 중요한 역할을 한다는 실험 근거들이 다수 존재함. 본 연구과제에서는 NOX1 및 NOX4를 매개로 발생하는 redox signaling이 간섬유화 바탕으로부터 발생하는 간세포암의 발암 및 종양 진행 (tumor initiation and progression)에 미치는 역할과 이에 관련된 분자기전을 규명하고자 하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
본 연구의 목표는 간내에 존재하는 NOX 1 및 4 상동체들을 매개로 발생되는 산화스트레스가 간세포뿐만 아니라 간성상세포, 및 면역세포 등 간내 종양미세환경(tumor microenvironment)에 미치는 차별적인 영향과 분자기전 연구를 통하여 간섬유화 바탕에서 발생하는 간암의 발암 및 진행기전을 규명하고자 하는 것임. NOX4KO 마우스에서 간섬유화바탕 간암발생 동물실험결과, NOX4KO 마우스에서 WT 마우스보다 유의하게 증가된 간종양발생이 관찰되었으며 종양내 증가된 세포증식이 관찰됨. 간섬유화바탕에서 NOX4 결핍의 간암발생 증가 기전을 규명하기위한 in vivo, in vitro 실험을 통하여 NOX4결핍이 간내 종양미세환경에서 CD206 양성 M2 대식세포 발현증가를 통하여 종양발생 증가를 유발함을 최초로 규명하였음. 또한 TGF-β/NOX4매개 간섬유화 신호전달과정에서 PYK2 (proline-rich tyrosine kinase2)를 매개로 하는 간섬유화 신호전달 기전을 최초로 규명함. 결과적으로 간섬유화바탕의 간암발병기전에서 NOX4 매개 간암발생 억제효과와 분자기전을 최초로 규명하여 연구목표를 달성하였음. NOX1의 경우 NOX1KO 마우스에서 DEN 및 CCl₄를 이용한 6개월 장기 간암유발실험을 2회 반복한 결과 동일하게 간암발생 증가소견을 관찰하였으며 이러한 결과는 기존에 보고된 연구결과와 차이가 있는 새로운 결과로서 기전규명을 위한 연구를 진행중임.

□ 연구개발결과의 중요성
간세포암의 특징은 대부분 간경변증이 있는 환자에서 발생하며 이러한 사실은 간세포암 발생과정에서 간섬유화 배경으로부터 종양미세환경 변화가 매우 중요하다는 점을 시사함. 본 연구팀은 간섬유화 바탕으로부터 발생하는 간암의 발암 및 종양진행 과정에서 NOX4결핍이 종양미세환경내 M2 대식세포 발현증가 기전으로 간암 발병 및 진행을 유발시키는 것을 규명하여 NOX4 매개 간암억제 기전을 최초로 보고하였음. 이러한 연구결과는 간경변 환자에서 발생하는 간암의 발병 및 진행을 억제하는 새로운 개념의 치료제 개발의 이론적 근거를 제시한 결과로서 신약개발로 연구할 가치가 매우 높음.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구개발의 필요성 ... 4
2) 최종연구목표 ... 6
3) 연구내용 및 범위 ... 6
2. 연구수행내용 및 연구결과 ... 7
1) WT, NOX4KO 마우스에서 간섬유화바탕 간암발생 장기간 동물모델 (DEN plus CCl₄ 투여 30주) 분석 결과 ... 7
2) WT, NOX4KO 마우스에서 단기간 간섬유화바탕 간암발생자극 동물모델 (DEN plus CCl₄ 투여 1주)에서 간암발생 관련 종양 미세환경 (microenvironment)내 면역세포 변화 분석 ... 10
3) NOX4결핍이 간암세포의 증식 및 면역세포의 표현형 변화에 미치는 영향 규명 실험 ... 12
4) TGF-β 간섬유화인자가 간성상세포에서 NOX4매개 간섬유화반응에 미치는 영향과 세포내 신호전달기전 규명 ... 13
5) NOX1KO 마우스에서 간섬유화바탕 간암발생의 비교 분석 실험 ... 14
3. 연구개발결과의 중요성 ... 15
4. 참고문헌 ... 16
5. 연구성과 ... 17
대표적 연구실적 ... 20
끝페이지 ... 20

표/그림 (20)

표 Progression from chronic hepatitis to liver cirrhosis and liver cancer
표 Structure of the different NOXs. Different homologues of NOX have been identified in different cells
표 Decreased hepatic fibrosis in NOX1 knock-out(NOX1KO) mice compared to wild-type (WT) mice
표 High NOX1 (A) or low NOX4 (B) expression within HCC is associated with shorter recurrence-free survival after curative surgical resection of HCC
표 (A) Experimental design of longterm animal model to assess HCC development from fibrotic background in WT and NOX4KO mice. (B) Liver to body weight (LW/BW) ratio of vehicle or DEN+CCl4 injected mice
표 (A) Representative images of the livers in longterm experiment of HCC arising from fibrotic background in WT (n=13) and NOX4KO mice (n=14). (B) Total tumor numbers of vehicle or DEN+CCl4 injected mice (left) and number of tumors according to tumor diameter in DEN+CCl4 injected mice (right)
표 (A) Representative images of liver sections that are stained with H&E from vehicle or DEN+CCl4 injected mice . (B) Serum AST and ALT levels. Serum was obtained at 4 weeks after the last CCl4 injection
표 Representative Srius red staining images (up) and its quantification (bottom). Images were analyzed dividing 2 regions; non-tumor (NT), tumor (T)
표 Representative staining images of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) (up), and percentages of positive-stained cells (bottom)
표 Gene expression analysis in vehicle or DEN+CCl4 injected mice livers
표 (A) Representative images of CD68 immunohistochemistry staining (left) with its quantification (right). (B) Representative images of CD206 immunohistochemistry staining (left) with its quantification (right)
표 Liver to body weight (LW/BW) ratio of vehicle or DEN+CCl4 injected mice
표 Representative FACS gating strategy for flow cytometry (FACS) analysis from liver cells after acute liver injury model using DEN plus CCl4 injections in WT (n=5) and NOX4KO mice (n=5)
표 FACS anlysis for the expression of (A) immune cells (B) CD86 positive immune cells (C) CD206 positive immune cells (D) M2/M1 ratio from isolated liver cells after acute liver injury using DEN plus CCl4 injections in WT and NOX4KO mice
표 Effects of NOX4 knockdown on cell proliferation in PLC/PRF/5 and Hep3B cell lines
표 Experimental design for investigating the effect of NOX4 deficiency in HCC cell lines on the phenotypic change of THP1 immune cells
표 (A) TGF-β induced upregulation of NOX4 and fibrogenic genes in human HSC LX2. (B) Inhibition of PYK2 by PYK2 inhibitor PF573271, suppresses TGF-β-mediated fibrogenic responses in HSCs
표 Inhibition of PYK2, but not FAK, suppresses upregulation of pro-fibrotic CTGF expression on stimuli of TGF-β1. (A, B) qPCR of fibrogenic gene expression in in vitro activated primary mouse hepatic stellate cell (mHSC) (A) and in LX2 (B), treated as indicated and shown as fold change (n=3). (C) Western blot of α-SMA in mHSC and LX2 after treatments. (D) Western blot of activated forms of both FAK and PYK2, and CTGF in LX2 treated as indicated (n=3). (E) qPCR of CTGF expression in LX2 that were treated with either of two FAK/PYK2 inhibitors (n=3). (F, G) After transfection with siRNAs of negative control, FAK or PYK2, qPCR of the indicated gene expression (F) and western blot (G) were performed. Two FAK/PYK2 dual inhibitors were used: PF271, PF-573271; PF228, PF573228. Student's t-test; *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.00
표 Liver to body weight (LW/BW) ratio of vehicle or DEN+CCl4 injected mice
표 (A) Representative images of the livers. (B) Numbers of tumors according to tumor diameter in DEN+CCl4 injected mice. Liver tissues were obtained at 4 weeks after the last CCl4 injection

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총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
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