초록 ▼

본 연구는 (1) 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구, (2) 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구, (3) 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석으로 연구내용을 세분화하여 진행하였으며, 연구주제별 연구목표 및 주요 연구 결과는 아래에 상세히 기술하였음

가. 연구사업의 목표
◯ 법적관리종의 보존 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구: 한반도 멸종위기종 3종(유착나무돌산호, 대추귀고둥, 고리도롱뇽)을 대상으로 집단유전학적 연구 수행 및 법정관리종 관련 정책 수립에 활용할 수 있는 기

본 연구는 (1) 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구, (2) 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구, (3) 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석으로 연구내용을 세분화하여 진행하였으며, 연구주제별 연구목표 및 주요 연구 결과는 아래에 상세히 기술하였음

가. 연구사업의 목표
◯ 법적관리종의 보존 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구: 한반도 멸종위기종 3종(유착나무돌산호, 대추귀고둥, 고리도롱뇽)을 대상으로 집단유전학적 연구 수행 및 법정관리종 관련 정책 수립에 활용할 수 있는 기초자료 제시
· (유착나무돌산호) 한반도 주변 해역을 중심으로 4개 권역(동해 외해권, 남해동부권, 완도권, 제주(추자)권)에서 권역별 5개체(또는 군체) 이상, 총 20개 이상의 샘플을 확보함. 유전적 다양도 평가를 위해 NGS 기반의 microsatellite (SSR) 마커 10개 이상을 선별하여 유전다양성 분석을 수행함
· (대추귀고둥) 주요 서식지를 중심으로 5개 권역(영광권, 해남권, 고흥권, 순천권, 사천권)에서 권역별 10개체 이상, 총 50개체 이상의 샘플을 확보함. 유전적 다양도 평가를 위해 NGS 기반의 microsatellite (SSR) 마커 10개 이상을 선별하여 유전다양성 분석을 수행함
· (고리도롱뇽) 국내 고리도롱뇽 개체군의 유전적 다양도 평가를 위해 4개 이상의 개체군(부산광역시 일대, 울산광역시 울주군 내륙습지 등 최소 4개 지역, 개체군 당 최대 20개체 등 80개체 이상)을 선정하고 NGS 기반의 microsatellite (SSR) 마커 10개 이상을 선별하여 유전다양성 분석을 수행함
◯ 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구: 한반도 고유종 2종(작은 말조개, 운문산반딧불이)과 기후변화민감종 2종(말매미, 북방산개구리)을 대상으로 유전적 다양성 분석 및 유전체 수준의 향후 연구 방향 제시
· (작은말조개) 우점개체군인 강원도 북한강 및 남한강 유역에서 각 20개체씩을 확보하고, 나머지 개체군은 현장 조사를 통해 개체 확보가 가능한 하천을 3개 지점 선정하여 각 10개체씩 샘플을 확보함(총 5개 유역, 70개체). 분자마커로 미토콘드리아 COI 유전자 및 NGS 기반의 microsatellite (SSR) 마커 10개 이상을 선별하고 유전적 다양성 분석 및 진화학적 분석을 수행함
· (운문산반딧불이) 제주도를 포함한 남부 지역을 중심으로 채집 가능성이 있는 개체군을 조사하여 5개 이상 지점을 선정, 개체군별로 10개체 이상 샘플을 확보하고 GBS 기반의 SNP 분석을 수행하고자 함. 운문산반딧불이의 계통진화학적 문제점을 해결하기 위해 근연종인 파파리반딧불이와 대마도에 서식하는 L. tsushimana에 대한 개체를 확보하여 비교분석을 수행함
· (말매미) 직접 조사를 통해 대표 개체를 선별하고 말매미 전장 유전체 염기서열을 우선적으로 확보함. 개체군분석의 경우, 제주도를 포함하여 채집 가능성이 있는 최소 3개 개체군을 선정, 총 30개체 이상의 샘플을 확보하고, deep sequencing을 통해 확보한 말매미의 유전체 정보를 참조서열로 나머지 개체의 resequencing을 통해 SNP 구간을 선별하여 통계분석을 수행함. 말매미 개체군의 특성을 고려하여 연차별 연구방향을 제안함
· (북방산개구리) 직접 조사를 통해 채집 가능성이 있는 최소 5개 개체군을 선정하고 개체군별로 10개체 이상 총 50개체 이상의 샘플을 확보하여 microsatellite (SSR) 마커를 이용한 유전적 다양성 분석을 수행함
◯ 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석: 한반도 자생 무미류 3종(계곡산개구리, 청개구리, 두꺼비)에 대한 유전체 정보 확보 및 기초 분석 수행
· (기초 유전체 분석) long read sequencing (Pacbio) 30Gb 이상, Genome size, GC contents, Genome complexity, mitochondrial genome mapping
· (전사체 분석) 무미류의 피부, 근육, 심장, 간, 신장 조직을 샘플링하여 조직별 전사체 정보를 확보, 조직별 특이적 발현유전자 정보를 분석함
· (비교유전체학적 분석) 3종의 무미류를 대상으로 전장 유전체 염기서열을 확보하고 3종간 유전체 특성을 비교분석하고자 함

나. 세부과제별 주요 연구 결과
1) 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구
◯ 유착나무돌산호
· (분석 개체 확보) 울릉도 2개 지점에서 3개체, 독도 1개 지점에서 5개체, 울진군 1개 지점에서 4개체, 완도군 1개 지점에서 2개체, 여수시 1개 지점에서 3개체, 그리고 부산광역시 1개 지점에서 3개체로 총 6개 지점 20개체를 확보하였음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) MGISEQ-2000 플랫폼을 이용하여 152,259,836개 read에 대해 약 45Gb에 해당하는 염기서열을 생산함. 이후 1차적인 assembly 과정을 통해 2,560,878개의 scaffold를 생성하였고, scaffold의 평균길이는 357bp로 확인됨
· (Microsatellite 마커 개발) 유전체 분석결과 총 75,973개의 microsatellite 마커후보군이 선발됨. 이 중에서 단일반복서열이 아닌 혼합된 좌위를 제외한 di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-를 가진 유전자 좌위 후보군 중 primer design이 가능하고 안정된 증폭 효율을 나타낸 10개의 SSR 마커를 최종 선정함
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 개발된 10개 마커 모두 PIC>0.5 이상으로 모든 마커를 집단분석에 안정적으로 사용될 수 있는 수준임.
근친계수(F_IS) 분석에서 모든 개체군이 음(-)의 F_IS 값이 관찰됨에 따라 심각한 유전적 감소가 이루어지는 상황은 아닌 것으로 판단됨. 분석에 활용한 5개의 개체군
모두 유전적 다양도가 적정 수준을 유지하고 있는 것으로 확인됨. 또한 F_ST, R_ST, PCoA 분석했을 시, 각 개체군 사이에 유전적으로 분화가 어느 정도 진행된 것으로 확인되며, 특히 울릉도를 기준으로 울릉도-울진, 울릉도-독도, 울릉도-완도 순으로 유전적 분화도 정도가 높은 것으로 확인되고 잠재적으로 3개의 유전적 그룹으로 나눌 수 있을 것으로 판단됨. 하지만 유효 개체수 부족으로 인해 유전적 구조 분석의 결과는 분석이 수행되지 못해 차후 추가적인 연구가 요구됨
· 본 연구결과에서는 한반도 해역에 서식하는 유착나무돌산호는 근친교배에 의해 심각한 유전적 감소가 이루어지는 상황은 아닌 것으로 판단됨. 하지만 주로 무성생식을 하고 군락을 형성하지 못하는 생태적인 특징으로 인해 독립 군체 내에서의 유전적 다양성은 매우 낮은 경향이 있으므로 지속적인 서식지 보존 관리가 필요함
◯ 대추귀고둥
· (분석 개체 확보) 대추귀고둥은 남해안 및 서해안을 중심으로 담수가 유입되고 갯잔디가 형성된 자연 해안에서 주로 서식함. 이 서식지를 토대로 총 7지점(부안군 2지점, 영광군, 강진군, 보성군, 하동군, 남해군)에서 55개체의 시료를 확보함
· (Microsatellite 마커 개발) Hyun et al. (2017)에 의해 보고된 한반도 대추귀고둥의 microsatellite 정보 (20개의 SSR)를 토대로 본 연구에서 확보한 대추귀고둥 개체군에 마커의 유용성 테스트를 수행함. 우선적으로 Hyun et al. (2017)에 보고된 PIC>0.9 수준의 마커를 선별하였고, 개체군별 PCR 실험에서 안정적인 결과를 나타내는 10개의 SSR 마커를 최종 선정함
· (Microsatellite 마커 및 COI 유전자에 기반한 유전적 다양성 분석) 선별된 10개의 모든 SSR 마커는 PIC>0.5 이상으로 informativeness를 확인함. 유전다양성 분석 결과, 대추귀고둥의 개체군별 근친계수(F_IS) 분석 결과는 모든 개체군에서 양(+)의 값을 나타내며, 근친교배로 인해 유전적 감소가 진행되고 있는 것으로 예측됨. 전반적인 유전적 다양성 분석에서 보면, 한반도에 서식하는 대추귀고둥 개체군은 유전적 구조가 확인되지 않으며 모두 하나의 개체군으로 볼 수 있는데, 이는 genotyping 및 COI 유전자 기반의 분석 결과에서 동일하게 지지하는 결론을 확인함. 다만, 개체군별로 분석 개체수가 적어서 개체군 간의 분석이 유의성 검증하기 위해서는 개체 추가 확보가 필요할 것으로 판단됨
· 본 연구결과에 따르면, 한반도 해역에 서식하는 대추귀고둥은 해양생물에서 전형적으로 나타나는 metapopulation의 특징을 보여줌: 1) 높은 haplotype diversity, 낮은 nucleotide diversity, 2) 유전적 구조 결핍, 3) 낮은 유전적 분화도(개체군간 빈번한 유전적 흐름). 한반도 대추귀고둥은 서식지 환경 조건에 따라 소멸과 이주를 반복하면서 서식지 단편화로 인해 하나의 metapopulation을 형성한 것으로 판단됨. Metapopulation의 특성상 대추귀고둥의 서식 범위 내에 생육환경이 적합한 곳은 어디나 새로운 개체군이 정착할 수 있는 공간이 되므로 전범위에 걸쳐 지속적인 모니터링 및 체계적인 관리가 필요함
◯ 고리도롱뇽
· (분석 개체 확보) 고리도롱뇽의 서식지로 알려진 한반도 동남부의 일부지역(부산광역시 기장군, 해운대구, 연제구, 부산진구, 금정구 일대; 경상남도 양산시 동면 일대; 울산광역시 울주군 일대)에서 꼬리 일부 채취 후 방사하였고, 현장 조사와 함께 비침습적 방법으로 유전자원 샘플을 확보함. 최종적으로 13개 지점에서 230개체를 확보하였음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) Nextseq 플랫폼을 이용한 NGS 분석 결과 총 17,655,112개의 read가 확보되었고, 총 염기서열은 5,314,188,712bp, GC contents는 47.34%, AT contents는 52.66%로 나타남. Quality Score가 20이 넘는 read의 비율인 Q20은 89.35%였고, 30이 넘는 비율인 Q30은 80.91%임
· (Microsatellite 마커 개발) 전체 171개의 primer 중 가용 형광 primer 22개 쌍이 선정되었고, 이 중 16개 쌍의 유용한 SSR 마커가 최종 선정됨
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 본 연구에서 유전자형 (genotype)으로 개체군 구조 분석을 수행한 결과, 고리도롱뇽 개체군 간에는 뚜렷한 유전적 분화현상은 나타나지 않았으나, 일부 개체군 간에는 미약한 유전적 분화현상과 개체군 구조가 확인되었음(경남 양산 개체군). 또한, 이들 개체군간 유전적 분화정도의 차이는 거리에 따라 유의미한 관계를 보이고 있었음. 이동성이 낮은 유미양서류의 특성상 고리도롱뇽 개체군간의 유전적 교류가 용이하지 않을 것으로 보이며, 이런 점들은 시간이 경과함에 따라 개체군간 분화가 서서히 이루어질 가능성이 있음
· 본 마커개발을 통한 멸종위기종인 고리도롱뇽 개체군의 유전적 다양성을 평가하고 개체군 구조를 파악한 연구결과를 토대로 고리도롱뇽 개체군이 보유하고 있는 고유 유전적 구조를 고려하여 종 보전계획 수립 시 기본 방안을 제시할 것임. 특히, 고유 대립인자들을 보유하고 있는 개체군들에 대한 관리감독과 각 지역 개체들에 대한 유전적 특징을 고려하여 고리도롱뇽의 보전 및 관리단위를 선정해야 할 것으로 보이며, 아울러 분포 서식지역 현황을 고려하여 보전단위를 선정해야 할 것임

2) 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구
◯ 작은말조개
· (분석 개체 확보) 북한강 수계 2개 지점에서 27개체, 남한강 수계 2개 지점에서 40개체, 낙동강 수계 2개 지점에서 27개체로 총 6개 지점에서 94개체 확보하였음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) MGISEQ-2000 플랫폼을 이용하여 123,191,029 개 read에 대해 약 36Gb에 해당하는 염기서열을 생산함. 이후 assembly 과정을 통해 5,529,425개의 scaffold가 생성되었으며, 평균 scaffold의 길이는 249bp로 확인됨
· (Microsatellite 마커 개발) 유전체 분석결과 총 281,288개의 microsatellite 마커 후보군이 선발됨. 이 중에서 단일반복서열이 아닌 혼합된 좌위를 제외한 di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-를 가진 유전자 좌위 후보군 중 primer design이 가능하고 안정된 증폭 효율을 나타낸 10개의 SSR 마커를 최종 선정함
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 말조개 및 작은말조개 개체군이 본 연구에서 개발된 10개의 마커를 이용했을 때, 대부분의 개체들이 명확하게 구분되는 것이 확인됨. 작은말조개 개체군 내에서 분석 시 높은 다양성이 관찰됨.
그리고 미토콘드리아 마커 기반 결과와 유사하게 낙동강 개체군이 다른 개체군과 유전적으로 차이를 보이는 것이 확인됨. 또한 미토콘드리아 마커 기반의 결과와는 달리, 북한강 지점 내 두 개체군(BH_CS, BH_GH) 사이의 유전적 차이가 높은 것으로 나타났으며, 이는 F_ST, R_ST, PCoA, Structure 분석 결과에서 모두 일관되게 확인됨
· (COI 및 16S rRNA 유전자에 기반한 유전적 다양성 및 구조 분석) 전반적인 결과들이 일관되게 낙동강 개체군이 북한강 및 남한강 개체군에 비해 유전적 다양성이 상대적으로 높은 것으로 확인됨. 또한 낙동강 개체군이 북한강 및 남한강 개체군과 유전적으로 많은 차이를 보이며 유전적 분화가 일어난 것으로 추측됨. 이는 계통수, TCS Network 및 PCoA 분석에서도 유사하게 나타남. 또한 작은말조개 개체군이 급속한 개체군 크기의 변동을 겪지 않고, 안정된 상태로 유지되어 온 것으로 확인됨
· 한반도 담수 수계에서 서식하는 작은말조개의 유전다양성 건강도는 적정수준을 유지하고 있으며, 내륙의 지리적 특성으로 산맥과 같은 지리적 장벽으로 인해 개체군간 유전적 구조도 확인되며, 현재 작은말조개는 한강수계(북한강, 남한강), 서해안 지역 수계, 낙동강 수계, 3개의 유전적 집단으로 나누어짐을 확인함. 작은말조개는 신생대 제3기 시작되는 시점에 근연종인 말조개에서 분지된 것으로 추정되며, 서해가 발달되지 않던 고황하수계 시점에서 중국에서 서해안 수계로 이입이 되어 현재까지 종분화가 진행되어 온 것으로 판단됨. 말조개와 작은말조개는 중부 이남지역(충청도)에서 공서하는 지역이 빈번하게 관찰되고 작은말조개는 주로 한강수계에서 우점적으로 서식함. 이는 작은말조개가 말조개와 생태계 내에서 서식경쟁이 일어나고 숙주 어류를 통해 산란하는 공통점으로 인해 숙주에 대한 선택적 경쟁으로 인해 발원지에서 이탈하여 다른 수계로 이동했을 것으로 추정함. 당해 연도의 기상환경의 좋지 않아 한반도 서부지역(충청, 전북, 전남) 지역의 개체를 확보하는데 어려움이 있었음. 따라서 추가 연구를 통해 작은말조개의 발원지로 추정되는 서부지역 개체군에 대한 추가적인 유전정보 확보가 진행되어야 할 것으로 생각됨
◯ 운문산반딧불이
· (분석 개체 확보) 운문산반딧불는 경상북도 청도군 운문산(8개체)을 포함한 제주도 제주시(9개체), 전라남도 장성군(10개체), 부산광역시(6개체)에서 개체를 확보함.
파파리반딧불이는 강원도 홍천군(10개체), 강원도 양양군(10개체), 그리고 새로운 채집지인 경상북도 영양군(10개체)에서 야간채집을 통해 개체를 확보함. 총 운문산반딧불이(파파리반딧불이 포함)는 7개 지점에서 63개체 확보하였음
· (COI 유전자에 기반한 유전적 다양성 및 구조 분석) 본 연구에서 확보한 7개 개체군 63개체와 선행연구에서 운문산반딧불이와 파파리반딧불이 그리고 L. tsushimana 로 등록된 15개 개체군 80개체 정보를 활용하여 총 16개 개체군 143 개체를 대상으로 공통영역 404bp의 염기서열을 이용하여 유전적 다양성 분석을 수행함. Haplotype을 분석한 결과, 총 41개 haplotype으로 확인되었으며 이를 “LU-BAR-H01~41”로 명명함. 각 개체군별 보유 haplotype의 수를 비교해보면 경상북도 청도 개체군이 10개로 가장 많은 haplotype을 보유함. 개체군간 유전적 거리(F_ST) 분석 결과, 모두 양의 값을 도출한 가운데 0.02488(순창 vs. 장성)~0.98403(순창 vs. 영양)의 범위를 나타냈으며, 평균 유전적 거리는 0.7590으로 높은 수준의 격리도를 나타냄. 또한, 주성분 분석을 수행한 결과, 전체 변이량의 절반에 못 미치는 45.29%로 유전적 거리(F_ST)값에 따라 개체군들의 위치가 산재되어 있음을 확인하였으며 운문산반딧불이 일부 소그룹을 제외하면 뚜렷한 종간그룹으로 나눌 수 없음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) NextSeq 플랫폼을 이용하여 150bp의 single-end 방식으로 운문산반딧불이에 대한 40,702,425,084bp의 염기서열을 생산하였고, 생산된 염기서열의 품질점수는 Q30에 도달하여 99.3%의 정확성을 나타냈으며, Q30 이상의 염기서열은 전체 62%에 해당함을 확인함. 이후 de novo assembly를 통해 STACKS를 이용하여 샘플별로 de novo assembly 후 read들을 맵핑한 결과, 평균 38%가 필터링 되어 62%로 최종 269,55,484bp 염기서열로 정리되었으며, depth의 경우 최소값 20 이상보다 높은 평균 38.79×로 확인됨 (data not shown)
· (Microsatellite 마커 개발) 최종 520,850개의 SNP loci를 확보한 가운데 필터링 옵션을 통해 genotype call rate가 높은 마커들만 선별하여 최종 2,157개의 SNP 마커를 선발함
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 각 개체군별 근친교배 지수 (F_IS)를 측정한 결과 0.043~0.308 범위로 모두 양의 값을 도출하여 국내 운문산반딧불이 개체군은 격리되어 있음을 추정해 볼 수 있으며, 이는 최근 개체군의 급격한 감소나 지리적 격리로 인해 무작위적인 교배가 아닌 근친교배가 이루어지고 있음을 시사함. 이러한 결과는 미토콘드리아 유전체 내의 DNA 바코드 영역을 이용한 개체군별 haplotype 분포 분석 결과에서 일부 타입이 2-3개 내지의 개체군과 공유하고 있는 것을 제외하곤 모두 개체군내 고유의 haplotype으로 개체군을 유지하고 있는 결과와 부합된 결과로 판단됨. 주성분 분석을 수행한 결과, 전체 변이량의 84.21%로 유전적 거리(F_ST)값에 따라 경상북도 영양, 청도, 부산이 하나의 소그룹을 형성하고, 전라남도 장성 및 제주도가 또 하나의 소그룹을 형성하고, 강원도 양양과 홍천이 가깝게 위치하여 그룹을 형성하여 크게 3개 그룹으로 분포함을 확인함. 추가적으로 유전적 격리의 원인으로 지리적 요인인지를 확인하기 위해 IBD 분석을 수행한 결과, 통계적으로 유의하게(P < 0.01) 거리에 따라 유전적 격리가 발생한 것으로 확인됨. 이러한 결과는 SNP 마커에 기반한 결과뿐만 아니라 미토콘드리아 마커의 결과와도 통계의 차이는 있지만 일치하는 결과임. 이로 미루어 보아 남한에 분포하고 있는 운문산반딧불이 각 개체군들은 지리적인 요인에 따른 유전적 격리 현상을 겪고 있는 것으로 판단됨
· 운문산반딧불이와 파파리반딧불이의 지역적 발생 조사결과를 종합해 보면 파파리 반딧불이는 다소 북쪽에서(예, 강원도) 운문산반딧불이는 다소 남쪽(예, 경상도 청도 운문산)에서 발생하는 것으로 알려져 있으나, 공서하는 지역이 발견됨(청도군 운문산, 강원도 홍천). 이는 실제 여러 형태 유형들이 전국적으로 섞여 함께 서식하는 것으로 추정됨. 1차년도 분석지역(홍천, 양양, 제주, 장성, 영양, 청도, 부산)에 추가하여 더 많은 발생지에서 추가 시료를 확보(강원도 화천 및 춘천, 충남 아산, 충북 옥천, 전남 담양, 전북 무주 및 부안 등)한 분석이 필요함. 또한, 대마도에 발생하는 Luciola tsushimana 를 포함한 SNP 마커를 이용한 집단유전학적 분석이 추가된다면 좀 더 명확한 3종간의 유연관계를 규명할 수 있을 것으로 판단됨
◯ 말매미
· (분석 개체 확보) 주 발생지인 제주도, 광주광역시 및 경상남도 산청군에서 주간채집을 통해 각 지역별 10개체씩 총 30개를 확보하였음
· (COI 유전자에 기반한 유전적 다양성 및 구조 분석) 30개체 COI 유전자 658bp를 분석한 결과, 총 9개의 haplotype을 확인하였음. Haplotype 분석 결과를 통해 haplotype 분포는 다소 지역 특이적임을 확인하였음. haplotype간 유전적 차이는 최소 1개 염기서열 변이(0.152%)에서 최대 6개 염기서열 변이(0.912%)였음(표II-2-42). 최대 염기서열변이는 제주에서만 발견된 CABAR07과 광주에서만 발견된 CABAR03을 비교하였을 경우 확인되었으나 pairwise 분석 결과 다양한 변이율을 보이는 염기서열 짝을 구성함으로 유전적으로 분화된 haplotype은 없는 것으로 보여짐. COI 유전자를 이용한 3개 개체군의 개체군간 유전적 격리(F_ST ) 및 유전자 이동률(N_m )를 계산한 그 결과, 광주와 산청은 0의 값을 도출하여 유전적 격리 보다는 유전적 교류가 있음을 확인할 수 있었으며, 제주도는 광주 및 산청개체군과 일정 크기의 유전적 거리가 높음을 확인함. 특히, 이들 거리는 모두 통계적으로 유의함(P < 0.05). 즉, 내륙 개체군인 광주와 산청 개체군은 하나의 유전개체군 이루고 있었으며 도서지역인 제주는 별개의 개체군을 형성함을 알 수 있었음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) MGISEQ-2000 플랫폼을 이용하여 read length 150, paired-end 방식으로 471,367,386개 read에 대해 약 141Gb에 해당하는 염기서열을 생산함(표 II-2-49). 이는 보편적인 곤충 genome size인 1Gb 미만을 기준으로 했을 시 약 140×에 해당하는 데이터 생산량임
· (Microsatellite 마커 개발) 전체 73,580,526개의 SNP loci에서 각 개체군 내 분석을 위해 최종 54,724,263개의 SNP loci를 확보하였으며, 개체군간 비교 분석을 위해 최종 6,630,159개 SNP loci를 확보하였음. COI 유전자를 이용한 분석결과와 유사한 결과로 내륙지역에 해당하는 광주 및 산청 개체군은 상대적으로 유전적으로 가까우며, 도서지역인 제주 지역이 상대적으로 유전적으로 먼 거리에 위치함을 보였으며 제주와 광주가 제주와 산청보다 다소 가까운 결과를 보여주었음
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 국내 기후변화민감종인 말매미 3개 개체군에 대한 SNP 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과, 말매미 2개 개체군(광주와 제주)에서 이형접합예측치(H_E)가 이형접합관측치(H_O)보다 상대적으로 낮게 나타났으며, 의미 있는 결과 도출을 위해서는 추후 추가 개체군의 분석을 통한 추론이 필요함. 그러나 근친교배 지수인 F_IS의 경우 모든 개체군에서 음의 값을 보여 말매미는 소개체군이나 유전적 격리에 의한 문제는 없는 것으로 사료됨. 추후 개체군의 확장, 기상환경이 다른 개체군(온도 및 강수량 등)을 연구대상에 포함하고 이들에 대한 추가 유전체 분석 후 outlier 분석을 수행하여 기후변화와 관련된 요인이 작용하는지에 대한 면밀한 고찰이 필요함
· 기후변화민감종의 한반도 적응 진화 및 환경변화 관련 적응 기작 규명을 위해 기후변화를 반영하는 마커를 개발하고 2단계 분석과정을 진행하도록 다년도 과제로 계획함: (1)말매미 1개체로부터 deep-sequencing을 수행하고 계통적으로 가장 유사분류군을 reference genome으로 이용하여 genome annotation 수행 및 (2)선발된 개체군 및 개체를 대상으로 resequencing을 통한 SNP 마커 선발 및 이를 이용한 “neutral” 상태의 유전적 다양성 및 유전적 관련성을 분석함. 본 연구는 1단계 연구과정으로 말매미의 deep sequencing을 통해 참조서열을 생산하였으며, 차년도 2단계 연구과정을 통해 (1)개체군별 기상정보 분석을 통한 개체군간 기후요인 차이 확인 및 (2)개체군 추가 확보를 통한 분석 개체군 확대 및 “neutral” 상태의 유전다양성 및 유전적 관련성을 분석하고 (3)선발된 SNP 중 기후변화에 잠재적으로 관련성이 있는 SNP 선발을 위한 outlier 분석 및 이를 이용한 유전적 다양성 분석, 참조유전체와 비교분석을 통해 기후변화와 관련된 유전자의 기능을 확인하고 장기적으로 이러한 기후 적응 관련 분자마커를 선발하여 기후변화에 따른 생물의 유전적 구성 변화를 진단하는데 활용하고자 함
◯ 북방산개구리
· (분석 개체 확보) 본 종의 분포지역으로 알려진 제주도를 포함한 한반도 중서부 내륙 습지 및 계곡에서 기존에 확보한 개체들의 유전자 시료와 2020년 본 종의 번식시기에 직접 채집한 유전자 시료를 확보하였음. 최종적으로 9개 지점에서 154개체를 확보하였음
· (NGS 기반의 기초 유전체 분석) Nextseq 플랫폼을 이용한 NGS 분석 결과 총 17,539,242개의 read를 확보하였고, 총 염기서열은 5,279,311,842bp, GC contents는 43.76%, AT contents는 56.24%로 나타남. Quality Score가 20이 넘는 read의 비율인 Q20은 89.78%였고, 30이 넘는 비율인 Q30은 82.33%임
· (Microsatellite 마커 개발) 전체 40개의 primer 중 가용 형광 primer 21개 쌍이 선정되었고, 이 중 13개 쌍의 유용한 SSR 마커가 최종 선정됨
· (Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석) 조사된 북방산개구리 개체군에서 13개의 유전자 분석 결과, 평균 대립인자 수는 A =10.3, 평균 이형접합자 빈도는 H_O=0.656, H_E=0.814로 각각 나타났으며 일부 개체군에서는 병목현상의 흔적도 발견되었음. 북방산개구리의 유전자형(genotype)으로 개체군 구조 분석을 수행한 결과, 북방산개구리 개체군들은 크게 2개의 유전적 구조를 형성하고 있는 것으로 나타났으며, 한반도 내륙개체군은 제주도 지역의 개체군들과는 유전적 구조에 뚜렷한 차이를 보임. 이는 제주도 개체군들이 RuMic6, RuMic28, RuMic34, RuMic35 등의 마커에서 내륙의 다른 개체군들과는 대립유전인자 구성에 차이를 보이는 것으로 확인됨
· 북방산개구리 개체군들은 우리나라에 유전적 구성이 뚜렷한 2개의 유전적 구조(제주도 지역의 개체군과 내륙개체군)를 보이고 있으므로, 본 마커개발을 통한 유전적 조사 결과는 이들 지역 개체군의 특성을 고려하여 종 보전계획 수립 및 인공증식에 대한 기본 방안 설정 시 근본적인 정보를 제공 할 것으로 보임. 특히 고유 대립인자들을 보유하고 있는 개체군들에 대한 관리감독과 각 지역 개체들에 대한 유전적 특징을 고려하여 향후 서식처 소실에 따른 개체수 감소와 기후변화에 의한 개체군의 변화양상을 평가하는데 실질적으로 적용할 수 있을 것으로 기대됨

3) 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석 분야
본 연구는 무미류 3종(계곡산개구리, 청개구리, 두꺼비)을 대상으로 전장유전체 확보 및 전사체 분석이 이루어졌으며, 분석 결과는 아래의 표 3과 4에 상세히 나타냄
◯ 기초 유전체 분석
· Long read sequencing system (15kb 이상)인 PacBio Sequel II를 통해 계곡산 개구리는 약 135Gb, 청개구리는 약 356Gb, 두꺼비는 약 234Gb의 유전체 염기서열을 확보함
· Paired end sequencing system (insert size 550bp)인 Illumina NovaSeq을 통해 계곡산개구리는 약 51Gb, 청개구리는 약 61Gb, 두꺼비는 약 60Gb의 데이터를 확보함
· 기초 데이터 분석을 통해 계곡산개구리의 유전체는 4.7Gb, 청개구리는 3.7Gb, 두꺼비는 4.2Gb로 예측됨
· NGS 데이터에서 1차 선별된 염기서열을 토대로 mitochondrial genome mapping을 수행하였으며, 계곡산개구리는 22,564bp, 청개구리는 15,343bp, 두꺼비는 17,713bp의 염기서열을 확보함

◯ 전사체 분석
· 무미류 3종을 대상으로 피부 조직을 포함한 근육, 위, 심장, 신장, 간에서 샘플 채취하고 각 조직별로 mRNA 라이브러리를 제작하여 Illumina NovaSeq 플랫폼을 이용하여 염기서열을 분석함. 6개 조직별 전사체 데이터 분석 결과, 계곡산개구리는 47Gb, 청개구리는 31Gb, 두꺼비는 32Gb의 전사체 서열 데이터를 확보함

(출처 : 요약문 5p)

Abstract ▼

“Next Generation Sequencing-Based Animal Resource Digital Sequence Utilization Study (3rd Year)” in 2020 was conducted in three parts: (1) Research on the genetic diversity to establish conservation policy of legal management species, (2) Research on genetic characteristics of endemic species and cl

“Next Generation Sequencing-Based Animal Resource Digital Sequence Utilization Study (3rd Year)” in 2020 was conducted in three parts: (1) Research on the genetic diversity to establish conservation policy of legal management species, (2) Research on genetic characteristics of endemic species and climate change-sensitive species on the Korean peninsula, (3) Research on the securing and characterizing three anuran genome. The goals of the research project and the main research results are described in detail below.

First, the analyses of genetic diversity and population structure for three Korean endangered species, including 20 samples from 5 populations in Dendrophyllia cribrosa, 55 samples from 7 populations in Ellobium chinense, and 230 samples from 13 populaions in Hynobius yangi, were conducted using the microsatellite markers (SSR) and mitochondrial COI . Several baseline guidelines or suggestions for conservation and management strategies of highly threatened species of Dendrophyllia cribrosa, Ellobium chinense, and Hynobius yangi in the Korean peninsula were proposed based on the findings of this study.

Second, the genome-wide analyses were performed with two endemic species of Unio douglasiae sinuolatus and Luciola unmunsana, and two climate change-sensitive species of Cryptotympana atrata and Rana uenoi on the Korean peninsula. In case of endemic species, the analyses of genetic diversity and population structure, including 94 samples from 6 populations in Unio douglasiae sinuolatus and 63 samples from 7 populations in Luciola unmunsana, were conducted using the new microsatellite markers (SSR and SNP) and mitochondrial COI / 16S rRNA . The adaptive evolutionary patterns (or scenario) of the endemic species on the Korean peninsula were confirmed based on the results of this study.

In case of the climate change-sensitive species of Cryptotympana atrata, the analyses of genetic diversity and population structure, including 30 samples from 3 populations, were conducted using the microsatellite markers (SNP) and mitochondrial COI . In the amphibian species of Rana uenoi, the analyses of genetic diversity and population structure, including 154 samples from 9 populations, were conducted using the microsatellite markers (SSR). The prediction of the distribution pattern of indigenous species in the Korean peninsula linked to climate change was proposed at the level of genome-wide analysis.

Finally, we conducted on the securing and characterizing an anuran genome for three species, which is Rana huanrenensis, Dryophytes japonicus, and Bufo gargarizans . In this research, we report the de novo assembly of whole-genome sequencing, mitochondrial genome sequencing, and whole-transcriptome along six tissues (muscle, stomach, heart, kidney, liver, and skin) from the three anuran species. For the Rana huanrenensis, Dryophytes japonicus, and Bufo gargarizans species, we generated 135Gb, 234Gb, and 356Gb genome sequence respectively using PacBio Sequel II, a long read sequencing platform (over 15kb). Through Illumina NovaSeq, a paired end sequencing system (insert size 550bp), the gained data were about 51Gb, 61Gb, and 60Gb for Rana huanrenensis, Dryophytes japonicus, and Bufo gargarizans, respectively. Mitochondrial genome mapping was conducted based on the first selected nucleotide sequence from the NGS data. The nucleotide sequences were obtained 22,564bp, 15,343bp, and 17,713bp for Rana huanrenensis, Dryophytes japonicus, and Bufo gargarizans, respectively. For the whole-transcriptome analysis, we collected the 6 tissues in three anuran species, and an mRNA library was created for each tissue and sequenced using the Illumina NovaSeq platform. As a result, the transcript sequence data were generated 47Gb for Rana huanrenensis, 31Gb for Dryophytes japonicus, and 32Gb for Bufo gargarizans, respectively.

(출처 : Abstract 16p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 요 약 문 ... 5
• Abstract ... 16
• 목차 ... 18
• Ⅰ. 연구사업의 개요 ... 20
• 1. 목적 및 배경 ... 20
• 가. 생물자원의 중요성 ... 20
• 나. 한반도 멸종위기종 ... 21
• 다. 한반도 고유 생물종 ... 22
• 라. 기후변화 생물지표종 ... 24
• 마. 디지털서열정보(DSI) 확보의 시급성 및 필요성 ... 26
• 바. 유전다양성 분석 연구의 시급성 및 필요성 ... 28
• 2. 주요 연구내용 ... 29
• 가. 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구 ... 29
• 나. 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구 ... 30
• 다. 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석 ... 31
• 3. 추진 체계 및 일정 ... 32
• 가. 연구사업의 추진 전략 ... 32
• 나. 연구진 구성 및 역할 ... 33
• 다. 연구사업의 추진 현황 ... 35
• Ⅱ. 결과 및 고찰 ... 36
• 1. 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구 ... 36
• 가. 당해 연도 연구대상종 ... 36
• 나. 연구방법 ... 37
• 다. 대상종별 분석결과 및 고찰 ... 41
• 2. 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구 ... 79
• 가. 당해 연도 연구대상종 ... 79
• 나. 연구방법 ... 79
• 다. 대상종별 분석결과 및 고찰 ... 88
• 3. 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석 ... 199
• 가. 당해 연도 연구대상종 ... 199
• 나. 연구방법 ... 201
• 다. 대상종별 분석결과 및 고찰 ... 204
• Ⅲ. 주요 연구 성과 및 제언 ... 231
• 1. 세부과제별 주요 연구 결과 및 제언 ... 231
• 가. 법적관리종의 보전 정책 수립을 위한 유전적 다양성 연구 ... 231
• 나. 한반도 고유종 및 기후변화민감종의 유전적 특성 연구 ... 233
• 다. 무미류 유전체 정보 확보 및 특성 분석 분야 ... 235
• 라. 출판논문 및 홍보자료 ... 236
• Ⅳ. 참고문헌 ... 239
• 부록 ... 247
• 끝페이지 ... 253