초록 ▼

본 연구는 A형 간염바이러스 유전자나 특성을 분석하고 수인성·식뭄매개 바이러스 검출 효율성 향상을 연구함

A형 간염바이러스 유전자나 특성을 분석을 위해 1) A형 간염바이러스 long template PCR 개발, 2) 차세대 염기서열 분석을 통한 유전자 정보 분석을 시행함. 유전자 분석 시 주관부서 협의에 따라 Illumina Miseq platform 또는 Nanopore MinION platform을 이용해 A형 간염바이러스 전장 유전체 30건 이상 분석을 목표로 하였음. 확보된 A형 간염바이러스 전장 유전체를 이

본 연구는 A형 간염바이러스 유전자나 특성을 분석하고 수인성·식뭄매개 바이러스 검출 효율성 향상을 연구함

A형 간염바이러스 유전자나 특성을 분석을 위해 1) A형 간염바이러스 long template PCR 개발, 2) 차세대 염기서열 분석을 통한 유전자 정보 분석을 시행함. 유전자 분석 시 주관부서 협의에 따라 Illumina Miseq platform 또는 Nanopore MinION platform을 이용해 A형 간염바이러스 전장 유전체 30건 이상 분석을 목표로 하였음. 확보된 A형 간염바이러스 전장 유전체를 이용하여 국내 유행 strain 확인과 생물 정보학 분석(bioinformatic analysis)을 활용한 reference 정립을 목표로 함. 또한, 조사 연구를 위해 3) 국내·외 A형 간염바이러스 유전자형별 집단사례, A형 간염바이러스 발생 식품 및 사람 매개 사례를 조사함. 이후 4) A형 간염바이러스 감염 감수성 높은 동물 세포 개발 후 A형 간염바이러스 감염확인을 통해 A형 간염바이러스 검출 민감도를 향상하고자 함. 문헌 조사를 바탕으로 국내·외 바이러스성 식중독 우려 식품을 목록화하고, 식중독 발병률이 높으면서 개선이 시급한 식품 matrix를 선정한다. 5) 식품 matrix 내 바이러스 검출 향상을 위한 바이러스 전처리(바이러스 탈리/농축/정제) 방법을 개선함. 전처리 방법 개선 시 식품의 물리 화학적 특성에 적합한 PCR inhibitors 제거방법을 개발하고 적용함. 이에 따른 6) 식중독 바이러스 유전자 검출 감도를 비교를 통해 검출 민감도를 향상 결과를 제시함. 개선된 전처리 시험법을 관계부처에 제공하여 개선된 시험법에 따라 수인성 및 식품 매개 바이러스의 오염에 취약한 식품을 안전하게 관리할 수 있도록 함.

A형 간염바이러스 역학 조사를 위하여 식품에서 검출된 A형 간염바이러스 long template PCR 개발을 완료함. 1차년도 RNA extraction과 cDNA 합성과 PCR을 위한 최적 enzyme을 선정하여 long template PCR primer 제작 및 검증을 완료함. 검증 결과 2.0 x 10²copies/mL 수준의 민감도 높은 PCR을 개발 완료함.

NGS를 이용한 유전자 정보 분석은 genome amplification을 기반으로 개발 완료함.
전처리, 유전자 증폭, WGS 분석에 대해 여러 방면을 검토하여 NGS를 이용한 유전자 정보분석법 정립을 완료함. 식품 시료에서 검출되는 A형 간염바이러스의 매우 낮은 농도를 고려하여 multiplex PCR을 통한 genome sequencing을 개발 완료함. Illumina MiSeq platform을 이용한 WGS 수행을 통해 식품에서 분리한 A형 간염바이러스 유전자 정보 및 인체 감염 사례로부터 총 28건의 50% 이상의 전장 유전체 확보를 완료함.

A형 간염바이러스 유전자형을 comparative genomics를 이용하여 분리된 A형 간염바이러스의 Phylogenetic analysis 수행함. 그 결과 국내에서 검출된 2019년도 각바지락은 IB type 5건, IA type 1건으로 genotyping됨. 본 연구에서 분석된 A형 간염바이러스 IB type간에는 동일한 조상으로부터 유례되었기는 하나, 그 distance가 멀어 2019년에 보고된 IB type A형 간염바이러스는 유전적으로 변이가 되었을 가능성이 큼. 하지만, 2019년 A형 간염바이러스 간염 환자로부터 얻은 혈청의 경우 모두 IA type으로 밝혀짐. 조개 젓갈에서 분리한 A형 간염바이러스 유전자와 비교하였을 경우 중국산 조개 젓갈에서 분리한 A형 간염바이러스 유전자가 국내 A형 간염 환자로부터 분리한 strain과 유전적으로 더욱 동일함. 이는 차후 면밀한 역학 조사가 추가로 행해져야 함을 의미함.

국가별 식품안전 관리 기관 및 감염질환 기관, 국내·외 학술논문 등 문헌 조사를 통해 집단 발생 A형 간염바이러스 유전자형을 분석하여 국내에는 IA, IB, IIIA 형이 유행함. 특히 2007년 이후 미국 등 국외에서 유행하는 유전자형 IB 형이 국내에도 보고됨. 국내·외 학술논문 등을 통한 A형 간염바이러스 정제 방법 조사 후 가장 효율적인 방법을 선택하여 식품에서 분리된 A형 간염바이러스를 정제하여 A형 간염바이러스 세포 감염에 이용하고자 함. A형 간염바이러스 세포 감염 민감도 향상을 위한 방법으로 유전자가위인 CRISPR Cas9을 사용하여 ISG 발현 조절 유전자인 irf3 또는 irf7을 knock-out 시킨 동물세포주 개발하고, wild type 세포와의 A형 간염바이러스에 대한 감수성을 비교 분석함.

현재 바이러스 오염도가 높은 식품군을 우선순위로 하여 패류(굴, 바지락), 패류로 제조된 젓갈. 베리류를 포함한 과일류, 잎채소를 포함한 채소류, 육류, 육류 가공품, 김치류, 즉석 식품류 순서로 전처리법을 개발함. 1차년도 연구에서는 최근 A형 간염바이러스에 의한 식중독 사고의 원인 식품이었던 패류(바지락, 굴)와 조개 젓갈에 대한 바이러스 탈리 및 농축법을 개선하였다. 2차년도에는 베리류를 포함한 과일류, 잎채소를 포함한 채소류, 육류, 육류 가공품, 김치류, 즉석식품류 전처리법을 개선함. 전처리법 개선 시 식품의 물리화학적 특성을 고려한 PCR inhibitors 제거법을 고안하여 바이러스 탈리/농축/핵산 정제 방법을 제시함. 전처리법 개선 대상과 방법은 식품의약품안전처 식중독 원인조사 시험법에 명시된 식품 matrix와 실험법을 준용함.

(출처 : 요약문 8p)

Abstract ▼

This study analyzes the hepatitis A virus genome characteristics and studies the improvement of the detection efficiency of water-borne and foodborne viruses.

To analyze the hepatitis A virus gene characteristics, 1) hepatitis A virus long template PCR is developed, and 2) hepatitis a virus

This study analyzes the hepatitis A virus genome characteristics and studies the improvement of the detection efficiency of water-borne and foodborne viruses.

To analyze the hepatitis A virus gene characteristics, 1) hepatitis A virus long template PCR is developed, and 2) hepatitis a virus genome information is analyzed through next-generation sequencing. We aimed to analyze more than 30 complete genomes of hepatitis A virus using Illumina Miseq platform or Nanopore MinION platform according to the agreement of the department in charge. Using hepatitis A virus whole genome, establish the reference gene for bioinformatic analysis and identification of domestic epidemic strains. In addition, 3) domestic and foreign hepatitis A virus genotype group cases, hepatitis A virus inducing foods, and human-mediated cases were investigated. 4) After the development of animal cells with high hepatitis A virus infection sensitivity. Based on the literature review, we listed the major food that was caused the viral food poisoning. 5) Improved virus pretreatment (virus desorption/concentration/purification) to improve virus detection in food matrix. When improving the pre-treatment method, a PCR inhibitor removal method suitable for the physical and chemical properties of food is developed and applied. 6) The result of improving the detection sensitivity is presented by comparing the detection sensitivity of the foodborne viruses. By providing the improved pretreatment test method to the relevant ministries, it is possible to safely manage food that is vulnerable to contamination of water-borne and food-borne viruses according to the improved test method.

Completed development of hepatitis A virus long template PCR detected in food for epidemiologic investigation of hepatitis A virus. In the 1st year, RNA extraction, cDNA synthesis, and the optimal enzyme for PCR were selected and long template PCR primer production and verification was completed. As a result of verification, a PCR with high sensitivity of 2.0 x 102 copies/mL has been developed.

Genetic information analysis using NGS has been developed based on genome amplification. By examining various aspects of pretreatment, gene amplification, and WGS analysis, the establishment of a genetic information analysis method using NGS was completed. Completed development of genome sequencing through multiplex PCR considering the very low concentration of hepatitis A virus detected in food samples. Through WGS performance using Illumina MiSeq platform, hepatitis A virus genetic information isolated from food and more than 50% of whole genomes from a total of 28 cases of human infection were obtained.

Phylogenetic analysis of the hepatitis A virus isolated using comparative genomics was performed. As a result, the 2019 clams detected in Korea were genotyped as 5 IB type cases and an IA type case. The hepatitis A virus IB type analyzed in this study was similar to the same ancestor, but the distance is far and the IB type hepatitis A virus reported in 2019 is highly likely to have been genetically mutated. However, in the case of serums obtained from hepatitis A virus hepatitis patients in 2019, all of them were found to be IA type. When compared with the hepatitis A virus gene isolated from clams, the hepatitis A virus gene isolated from Chinese clams is more genetically identical to the strain isolated from domestic hepatitis A patients. This means that more detailed epidemiological investigations should be conducted in the future.

Hepatitis A virus IA, IB, and IIIA types are prevalent in Korea by analyzing the genotype of the hepatitis A virus that occurs in a group through literature research such as national food safety management organizations, infectious disease institutions, and domestic and foreign academic papers. In particular, genotype IB, which is prevalent in foreign countries such as the United States since 2007, has also been reported in Korea. After investigating the hepatitis A virus purification method through domestic and foreign academic papers, the most efficient method was selected to purify the hepatitis A virus isolated from food, and it is necessary for hepatitis A virus cell infection. As a method to improve the hepatitis A virus cell infection sensitivity, we developed an animal cell line knock-out of irf3 or irf7, which is an ISG expression control gene, using CRISPR Cas9, a gene scissors, and susceptibility to hepatitis A virus with wild-type cells. comparatively analyzed.

Salted seafood made from shellfish (oysters, clams) and shellfish by prioritizing food groups with high virus contamination. The pretreatment method was developed in the order of fruits including berries, vegetables including leafy vegetables, meat, processed meat products, kimchi, and instant foods. In the first year study, virus removal and concentration methods were improved for shellfish (clams, oysters) and salted clams, which were recently food poisoning accidents caused by hepatitis A virus.

In the second year, the pretreatment method for fruits including berries, vegetables including leafy vegetables, meat, processed meat products, kimchi, and instant foods was improved. When improving the pretreatment method, we devised a method for removing PCR inhibitors considering the physical and chemical characteristics of food, and suggested virus removal/concentration/nucleic acid purification methods. The target and method of pretreatment improvement apply mutatis mutandis to the food matrix and test method specified in the Food Poisoning Cause Investigation Test Method of the Ministry of Food and Drug Safety.

(source : Summary 11p)