보고서 정보
주관연구기관 |
고려대학교 Korea University |
연구책임자 |
송준영
|
참여연구자 |
서호성
,
지현정
,
장아영
,
안기범
,
조금준
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2021-10 |
과제시작연도 |
2021 |
주관부처 |
식품의약품안전처 Ministry of Food and Drug Safety |
등록번호 |
TRKO202200005075 |
과제고유번호 |
1475012324 |
사업명 |
의약품등안전관리(R&D) |
DB 구축일자 |
2022-07-23
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키워드 |
b군 연쇄구균.단클론항체.백신.참조물질.Type B streptococcus.Monoclonal antibody.Vaccine.Reference material.
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초록
▼
b군 연쇄구균(group B streptococci, GBS) 감염은 신생아와 영아에서 질병부담이 크고,노인과 만성질환자에서도 b군 연쇄구균에 의한 중증감염 사례가 증가하고 있음.세계보건기구(WHO)와 글로벌 백신업체는 5가 GBS 단백접합백신 개발을 진행하고 있음. 따라서, 백신 도입 전 백신의 면역원성 평가를 위한 시험법 구축이 필요하며, GBS 혈청형 특이 단클론항체는 피막다당류 정제 및 면역원성 평가법(ELISA, OPA)의 고도화와 정도관리를 위해 필수적임. 본 연구를 통해서 GBS 5개 주요 혈청형에 대한 피막다당류 단클
b군 연쇄구균(group B streptococci, GBS) 감염은 신생아와 영아에서 질병부담이 크고,노인과 만성질환자에서도 b군 연쇄구균에 의한 중증감염 사례가 증가하고 있음.세계보건기구(WHO)와 글로벌 백신업체는 5가 GBS 단백접합백신 개발을 진행하고 있음. 따라서, 백신 도입 전 백신의 면역원성 평가를 위한 시험법 구축이 필요하며, GBS 혈청형 특이 단클론항체는 피막다당류 정제 및 면역원성 평가법(ELISA, OPA)의 고도화와 정도관리를 위해 필수적임. 본 연구를 통해서 GBS 5개 주요 혈청형에 대한 피막다당류 단클론항체를 개발하고, OPA/ELISA을 이용해 단클론항체의 specificity와 affinity를 평가하고자 하였음. 단클론항체 제작을 위한 첫 번째 단계로, 면역 유도에 필요한 혈청형 10종의 b군 연쇄구균 균주를 선별하여 대량 배양하였고, lysozyme법을 사용하여 피막다당질을 분리정제하였으며, ELISA 시험법으로 특이도를 검증하였음. Hybridoma fusion을 위해서 고전적인 PEG (polyethylene glycol) 법, Electrofusion 법과 semi-solid fusion 방식을 비교하였으며, 특이 항체를 생성하는 단세포를 분리하는 cloning 효율이 높은 semi-solid 방식을 사용하는 것으로 최종적으로 결정하였음. 정제한 피막다당질을 BSA 접합 후 마우스에 접종해 면역을 유도하였음(CRM197을 사용했을 때 오히려 낮은 효율을 보였음). 단클론항체 제작을 위해서 semi-solid 방식으로 hybridoma fusion을 시행하고 positive & negative screening을 통해서 단클론항체를 선별하였는데, 피막다당질항원에 대한 단클론항체 선별 효율은 약 1/200 수준으로 일반적으로 알려져 있는 단백질 항원에 대한 단클론항체 선별 효율에 비해서 매우 낮았음. 반복적인 실험을 통해서 serotype III를 포함하여 총 5개 단클론항체(Ib, II, III, VIII, GBC)를 확보하였음. 선별 제작한 단클론항체를 이용하여 opsaonophagocytic assay (OPA) 밸리데이션을 하였으며, 옵소닌화 지수의 변동계수(CV) 10% 미만의 높은 정밀도를 보였음. OPA 실험상 ELISA를 통해 Ib, II, III, VIII 또는 GBC에 특이적인 단클론항체임을 확인하였으나 혈청형 III를 제외하면 opsonophagocytosis를 유도하지 못 하였음. GBS의 경우는 피막다당질의 두께가 얇고 표면단백의 종류 와 양이 풍부해서 주요 표면단백이 병독성과 방어면역에 중요한 역할을 할 가능성이 높음.
Alpha-C-protein, C-alpha-like protein, Srr1/2 protein 등이 백신 타겟 항원으로 연구 개발되고 있으며, 이들 단백질 항원에 대한 단클론항체 개발과 면역원성 평가법 개발이 필요하겠음
(출처 : 요약문 6p)
Abstract
▼
Group B Streptococcus (GBS) is a leading cause of sepsis in infants as well as chorio- amnionitis in pregnant women. The World Health Organization (WHO) and global vaccine companies are developing a 5-valent GBS conjugate vaccine. Therefore, it is necessary to establish assay methods to evaluate the
Group B Streptococcus (GBS) is a leading cause of sepsis in infants as well as chorio- amnionitis in pregnant women. The World Health Organization (WHO) and global vaccine companies are developing a 5-valent GBS conjugate vaccine. Therefore, it is necessary to establish assay methods to evaluate the immunogenicity before introducing the vaccine, and the GBS serotype-specific monoclonal antibody is essential for the quality control of capsular polysaccharide purification and immunogenicity evaluation methods (ELISA, OPA). This study aimed to develop capsular polysaccharide monoclonal antibodies against five major GBS serotypes and to evaluate the specificity and affinity of monoclonal antibodies using OPA/ELISA. As a first step for monoclonal antibody production, 10 serotype GBS strains necessary for immune induction were selected and mass-cultured, the capsular polysaccharide was isolated and purified using the lysozyme method, and the specificity was evaluated by ELISA test. For hybridoma fusion, the classical PEG (polyethylene glycol) method, electrofusion method, and semi-solid fusion method were compared, and it was finally decided to use the semi-solid method with high cloning efficiency to isolate single cells that produce specific antibodies. Immunization was conducted by inoculating mice with purified capsular polysaccharide (PS) after BSA conjugation, which showed rather higher efficiency than using CRM197. For the production of monoclonal antibodies, hybridoma fusion was performed in a semi-solid method and monoclonal antibodies were selected through positive and negative screening.
The cloning efficiency of PS monoclonal antibody was much lower (1/200) compared to protein monoclonal antibodies. Through repeated experiments, a total of 5 monoclonal antibodies (Ib, II, III, VIII, GBC) were obtained. The opsaonophagocytic assay (OPA) was validated using the selected monoclonal antibody, and the coefficient of variation (CV) of the opsonization index showed high precision of less than 10%. In OPA experiments, although ELISA confirmed that the monoclonal antibody was specific for Ib, II, III, VIII or GBC, opsonophagocytosis could not be induced except for serotype III. In the case of GBS, the capsular polysaccharide layer is thin, and diverse kinds of surface proteins are abundant. Therefore, it is highly likely that major surface proteins play an important role in virulence and protective immunity. Alpha-C-protein, C-alpha-like protein, and Srr1/2 protein are being researched and developed as vaccine target antigens.
(source : Summary 8p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 최종보고서 ... 2
- 제 출 문 ... 3
- 목차 ... 4
- Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 6
- 국문 요약문 ... 6
- Summary ... 8
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
- 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 10
- 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 19
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 33
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 67
- 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 69
- 제6장 총괄참고문헌 ... 70
- 제7장 총괄첨부서류 ... 72
- 끝페이지 ... 76
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