초록 ▼

엔도톡신은 그람음성균의 외막 지질다당류로, 체내에 들어왔을 때 강력한 발열을 일으키는 물질이다. 의약품 생산공정에서 반드시 제거되어야 하는 물질로 엔도톡신이 기준 이하로 관리됨을 확인하기 위해 주사제의 품질관리 시험항목으로 엔도톡신시험을 설정하고 있다.
엔도톡신 시험은 투구게의 혈구추출성분으로 만든 라이세이트(Lysate) 시약을 사용하여 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법으로 약 50년 넘게 사용되고 있으나, 최근 투구게의 개체수 감소에 따른 시약 공급의 한계가 있으며 동물윤리에 따라 국제적으로 동물 대체시험법 연구필요성이

엔도톡신은 그람음성균의 외막 지질다당류로, 체내에 들어왔을 때 강력한 발열을 일으키는 물질이다. 의약품 생산공정에서 반드시 제거되어야 하는 물질로 엔도톡신이 기준 이하로 관리됨을 확인하기 위해 주사제의 품질관리 시험항목으로 엔도톡신시험을 설정하고 있다.
엔도톡신 시험은 투구게의 혈구추출성분으로 만든 라이세이트(Lysate) 시약을 사용하여 엔도톡신을 검출 또는 정량하는 방법으로 약 50년 넘게 사용되고 있으나, 최근 투구게의 개체수 감소에 따른 시약 공급의 한계가 있으며 동물윤리에 따라 국제적으로 동물 대체시험법 연구필요성이 대두되고 있다. 그리고 LAL(Limulus amebocyte lysate) 시험법이 가진 β-Glucans에 의한 위양성을 극복하기 위해 LAL Cascade 반응에서 처음 작용하는 Factor C를 재조합기술을 이용하여 만든 rFC (recombinant Factor C)을 이용한 엔도톡신 대체시험법이 개발되었다.
이러한 rFC를 이용한 엔도톡신 대체시험법은 최근 영국, 일본, 중국에서는 약전에 등재하였으며, 미국도 현재 약전 등재(안)의 의견 수렴 중에 있다. 우리나라의 경우 rFC를 이용한 엔도톡신 대체시험법에 대한 연구를 시작하고 있는 단계이며, 국내 제약사에서도 rFC 시험법의 적용 가능성을 확인하고 있는 상황이다.
이에 본 연구에서는 기존의 LAL 시약을 이용한 엔도톡신 시험법과 재조합 단백질을 이용한 엔도톡신 대체시험법간 시약에 따른 차이를 확인하고 재조합 단백질을 이용한 대체시험법을 검증하고자 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성을 확인하였다. 또한 백신, 유전자재조합의약품 및 항독소를 대상으로 기존의 LAL 시험법과 rFC 시험법을 통해 엔도톡신 시험을 수행하여 대체 시험법의 적용가능성을 검토하였다. 이 결과, 기존 LAL시험법에 대한 rFc 시험법의 대체 가능성을 확인할 수 있었다. 다만, 엔도톡신 시험을 수행할 때는 제제에 포함된 첨가제의 특성 등을 고려하여 반응간섭인자 확인시험, 최대유효희석배수 등 예비시험을 통한 적절한 시험법을 설정하는 것이 중요한 것으로 보여진다. 이에 따라, 본 연구에서는 재조합 단백질을 이용한 엔도톡신 시험법의 SOP 4종과 생물학적 기준 및 시험방법 신설항(안)을 마련하였다.
본 연구를 통해 향후 의약품 개발연구와 품질관리에 엔도톡신 시험법의 대체시험법을 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

(출처 : 요약문 3p)

Abstract ▼

Endotoxins are lipopolysaccharides that are found on the outer membrane of Gram-negative bacteria.
The presence of endotoxins in injectable pharmaceutical products leads to a high fever when released within the human body. Therefore, endotoxin testing constitutes one of fundamental quality contro

Endotoxins are lipopolysaccharides that are found on the outer membrane of Gram-negative bacteria.
The presence of endotoxins in injectable pharmaceutical products leads to a high fever when released within the human body. Therefore, endotoxin testing constitutes one of fundamental quality control requirements for injectable medicines to ensure that the pyrogen content is reduced below the acceptance criteria in manufacturing processes.
Over the past five decades, the horseshoe crab’s hemolymph has been the source of the lysate reagent for endotoxin detection and quantification. However, the dependence on horseshoe crabs has raised the issue of limited reagent supply due to a decrease in the horseshoe crab population. Ethical questions surrounding the continued use of the animals have also brought global attention to the need for alternatives to the animal source. Furthermore, the interference of β-glucans with the Limulus amebocyte lysate (LAL) test can give false positive endotoxin results.
To address these challenges, researchers developed an animal-free alternative called the recombinant factor C (rFC) assay that uses a recombinant form of the first precursor protein factor C in the LAL cascade. The rFC assay has recently been officially incorporated into pharmacopeias in the UK, Japan, and China for endotoxin testing. The US authority is also inviting comments on the proposal to include the rFC test in the US Pharmacopeia. Meanwhile, research is ongoing in South Korea on rFC-based endotoxin analysis, and Korean pharmaceutical companies are contemplating on adopting the rFC test method.
Against this backdrop, the present study aimed to explore the difference between the rFC and LAL assays and evaluate the specificity, linearity, accuracy, and precision of the rFC assay. The results from the two analytical methods were compared using samples of some biologics including vaccines, recombinant pharmaceuticals, and antitoxins to verify the applicability of the rFC test method in endotoxin detection. Our results demonstrated the potential of rFC as an alternative to LAL.
However, we also found that the choice of assays needs to be guided by preliminary analyses of inter alia interfering factors and the maximum valid dilution, where the properties of preparation additives and other factors have to be considered. Based on these findings, we proposed a new Article in the draft Minimum Requirements of Biological Products and developed four standard operating procedures (SOPs) for endotoxin testing.
These outcomes are expected to boost pharmaceutical innovation and further improve quality control by providing the framework to evaluate the presence of endotoxins.

(source: Summary 4p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 3
• Summary ... 4
• 목차 ... 5
• 연구개발과제 연구결과 ... 6
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 14
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 18
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 47
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 49
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 50
• 제7장 참고문헌 ... 51
• 제8장 첨부서류 ... 53
• 끝페이지 ... 101