초록 ▼

만성 중증 심장질환은 세계 사망원인 1위인 난치성 질환으로 현재까지 근원적인 치료법이 없어 이에 대한 치료제 개발이 절실히 필요하다. 최근 유도만능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 세포·유전자치료제 개발연구가 활발히 진행되고 있고, 임상진입을 위해 세계 각국이 노력하고 있다. 그러나, 세포배양 및 분화과정에서 동물유래물질이 다수 포함되는 경우가 있어 품질평가 및 임상적용에 어려움 있고, 유도만능줄기세포 유래 심근세포치료제에 대한 특성 및 품질평가법의 마련도 미흡한 실정이다.
본 과제에서는 동물유래물질을 배제한 조건에서 배양·분화

만성 중증 심장질환은 세계 사망원인 1위인 난치성 질환으로 현재까지 근원적인 치료법이 없어 이에 대한 치료제 개발이 절실히 필요하다. 최근 유도만능줄기세포 유래 심근세포를 이용한 세포·유전자치료제 개발연구가 활발히 진행되고 있고, 임상진입을 위해 세계 각국이 노력하고 있다. 그러나, 세포배양 및 분화과정에서 동물유래물질이 다수 포함되는 경우가 있어 품질평가 및 임상적용에 어려움 있고, 유도만능줄기세포 유래 심근세포치료제에 대한 특성 및 품질평가법의 마련도 미흡한 실정이다.
본 과제에서는 동물유래물질을 배제한 조건에서 배양·분화시킨 사람 유도만능줄기세포 유래 심근세포(hiPSC-CM)에 대한 특성분석 및 품질평가법, 면역원성 평가법 등을 제시하고자 한다. 먼저, 세포배양 환경에서 동물유래물질의 유/무(xeno-free/non-xeno-free)에 따른 유도만능줄기세포의 특성을 비교
석하기 위해 세포형태, 증식률 및 생존율을 측정하고, 줄기세포의 특징을 Alkaline Phosphase 분석법, 세포면역형광염색법 등을 통하여 비교·확인하였다. Xeno-free 배양환경에서 자란 유도만능줄기세포는 non-xeno-free로 배양한 세포보다 증식능과 생존율이 높게 나타났으며, 줄기세포 마커인 NANOG, OCT-4, SOX2도 높게 발현되고 있음을 확인하였다. 다음으로, 동물유래물질을 배제한 지지체와 배지를 이용하여 사람 유도만능줄기세포에서 심근세포로의 분화법을 성공적으로 확립하였다. hiPSC-CM에서 심근세포 특이적 마커인 cTnT, MHC-β가 높게 발현되었으며, 심근세포의 활발한 박동(beating)이 관찰되었다. 또한 hiPSC-CM의 전기생리학적인 기능을 평가하기 위하여, xeno-free 또는 non-xeno-free환경에서 심근세포로 2-4주 분화시킨 후 다중전극판분석법(MEA)와 Ca2+ imaging system을 이용하여 수축능과 세포내 칼슘진동(Ca2+ oscillation)을 측정하였다. MEA 결과, xeno-free 방법으로 배양한 심근세포의 필드포텐셜 값은 non-xeno-free 방법으로 배양한 심근세포에 비해 2주째부터 빠르게 증가됨을 관찰하였으나, 분화 4주째에는 두 조건에서 모두 비슷하게 증가되는 양상을 보였다. 반면, 칼슘진동은 xeno-free로 분화시킨 심근세포에서 더 낮은 값을 나타내었다. 동물유래물질의 하나인 Neu5Gc의 유무를 효소면역측정법(ELISA)으로 확인한 결과, xeno-free 배양액 및 hiPSC-CM에서는 Neu5Gc가 검출되지 않았다. 유도만능줄기세포에서 심근세포로 분화하는 동안 유전적 안정성을 확인하기 위하여 차세대염기서열분석법으로 종양패널을 이용한 targeted panel sequencing방법과 sanger sequencing방법을 수행하였으며, 이를 통해 동물유래물질의 유/무에 상관없이 잠재적 종양원성이 추정되는 두 유전적 변이를 확인할 수 있었다.

이상과 같이, xeno-fee 배양환경에서 유도만능줄기세포의 증식 및 심근세포로의 분화법을 성공적으로 확립하였으며, RT-PCR, Western blot, 유세포분석법, 다중전극판분석법, 칼슘진동측정법 등을 이용한 hiPSC-CM의 특성분석 및 품질평가 시험법을 제시하였다. 또한 ELISA방법으로 동물유래물질 유/무를 확인하였으며, 차세대염기서열분석법으로 유전적 안정성을 평가하였다. 본 연구결과는 유도만능줄기세포 유래 세포·유전자치료제의 개발에 유용한 정보가 되리라 생각하며, 허가·심사 시 활용할 수 있는 품질평가의 기초자료로 활용되기를 기대한다.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

Chronic heart disease is a number one cause of death worldwide. Although enormous efforts using drugs and surgical interventions have been made to treat cardiovascular disease, the fundamental problems of impaired myocardial functions with severe cardiomyocytes loss remain unsolved. Human induced pl

Chronic heart disease is a number one cause of death worldwide. Although enormous efforts using drugs and surgical interventions have been made to treat cardiovascular disease, the fundamental problems of impaired myocardial functions with severe cardiomyocytes loss remain unsolved. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an attractive cellular source for cardiac regeneration. However, it is reported that the use of animal-derived xenogenic materials during cell culture can trigger tumorigenicity or unexpected immune response. To overcome these concerns, we developed xeno-free(XF) differentiation method enhancing functional myocyte contractility and performed the characteristic analysis of hiPSC-CMs for assessment of quality control.

First, the characteristics of human iPSC with XF- or non-XF conditions were analyzed by cell morphology, qRT-PCR, immunostaining, and flow cytometry. XF-hiPSC showed higher proliferation and survival rate compared to non-XF-hiPSCs. XF-hiPSCs also showed high expression levels of the stem cell markers such as NANOG, OCT-4, SOX2. Next, we established the differentiation protocol for hiPSC-CMs with/without animal-derived xenogenic materials. XF-hiPSC-CM showed more vigorous beating activity at 2wk after differentiation compared to non-XF-hiPSC-CM. The expressions of cardiac specific markers such as cTnT, MHC-β were detected higher in XF-hiPSC-CM than in non-XF-hiPSC-CM. For functional assessment of hiPSC-CM, we measured in vitro contractility and intracellular Ca2 oscillation by using multiple electrode plate analysis (MEA) and Ca2 imaging system. The electrophysiological properties such as BPM, field potential amplitude (FPA), and FPDcF were significantly increased at 4wk compared to 2wk after differentiation in both XF- and non-XF-hiPSC-CM. Interestingly, the mean FPA was higher in XF-hiPSC-CM than non-XF-hiPSC-CM at 2wk, implying early onset of differentiation process into XF-hiPSC-CM.
But, the calcium oscillation was detected as a lower level in XF-hiPSC-CM than Non-XF-hiPSC-CM. Animal-derived Neu5Gc was not detected in XF-hiPSC-CM by ELISA. To assess genetic stability during differentiation from iPSCs to cardiomyocytes, we used next-generation sequencing such as targeted (tumor) panel sequencing followed by confirming them with Sanger sequencing. We detected two genetic mutations that could be associated with potential tumorigenicity regardless of the presence or absence of animal-derived substances.

In this study, we have successfully established XF-differentiation protocol for hiPSC-CM having enhanced cardiomyocyte contractility. We suggested the quality evaluation methods of hiPSC-CM using qRT-PCR, Western blot, flow cytometry, MEA, and Ca2 oscillation assay. We also demonstrated that Neu5Gc, an animal-derived immunogenic protein, was not detected in XF-hiPSC-CM and XF-media by ELISA. Genetic stability was assessed by next-generation sequencing. These results would be contributed to developing a new therapeutic source of cardiomyocyte and provide consideration points for quality control of hiPSC-CM-based cell therapy products.

(source: Summary 6p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 최종보고서 ... 2
• 국문 요약문 ... 4
• Summary ... 6
• 목차 ... 8
• 연구개발과제 연구결과 ... 9
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 9
• 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 14
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 20
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 73
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 83
• 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 84
• 제7장 참고문헌 ... 86
• 제8장 첨부서류 ... 89
• 끝페이지 ... 103