보고서 정보
주관연구기관 |
국립암센터 National Cancer Center |
연구책임자 |
김용연
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참여연구자 |
임가은
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2020-02 |
과제시작연도 |
2018 |
주관부처 |
보건복지부 [Ministry of Health & Welfare(MW)(MW) |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO202200008759 |
과제고유번호 |
1465028612 |
사업명 |
질환극복기술개발(R&D) |
DB 구축일자 |
2022-09-24
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키워드 |
순환종양세포.전이.이질성.circulating tumor cell.metastasis.heterogenity.EMT.
|
초록
▼
연구의 목적 및 내용
A. 최종 목표:
순환종양세포 (CTC)의 이질성과 전이특성을 분석하여 암 전이를 억제하는 치료제 개발, liquid biopsy, drug response, 바이오 마커 발굴의 기초 제공
B. 세부목표:
1. 유방암전이동물에서 CTC 분리와 배양 및 세포주 확립 프로토콜
2. CTC heterogeneity 특성 분석
3. CTC의 EMT와 전이 특성 분석
4. CTC의 전이 분자와 기전 탐색
5. 전이 분자 억제자 탐섹과 동물모델에서 CTC 유무 조사
6. 탐
연구의 목적 및 내용
A. 최종 목표:
순환종양세포 (CTC)의 이질성과 전이특성을 분석하여 암 전이를 억제하는 치료제 개발, liquid biopsy, drug response, 바이오 마커 발굴의 기초 제공
B. 세부목표:
1. 유방암전이동물에서 CTC 분리와 배양 및 세포주 확립 프로토콜
2. CTC heterogeneity 특성 분석
3. CTC의 EMT와 전이 특성 분석
4. CTC의 전이 분자와 기전 탐색
5. 전이 분자 억제자 탐섹과 동물모델에서 CTC 유무 조사
6. 탐색전이 분자와 사람유방암에서 전이 상관성 분석
(1) 1차년도(2017)
유방암 전이 모델을 이용한 순환종양세포의 분리 및 배양과 heterogeneity
a. 유방암전이동물모델에서 CTC 분리와 배양 및 세포주 확립 프로토콜
- 4T1/luc cell이용하여 syngeneic mouse에서 전이 모델 수립
- ClearCell FX System을 이용하여 CTC를 분리함.
- 분리된 CTC를 배양함
b.순환종양세포주(CTC)의 heterogeneous clone 분리 및 세포주 확립
- 분리된 순환종양세포주의 각 clone을 분리
- 각 clone을 배양하여 세포주 확립
- 각 clone이 tumor origin인 것을 luciferase activity로 조사
c. CTC heterogeneity 특성 분석
- 각 clone의 이질성을 세포형태학적으로 조사
- 각 clone의 이질성을 cell growth로 조사
- 각 clone의 이질성을 표피 세포와 중간엽세포의 특정 단백질 발현으로 조사
(2) 2차년도(2018)
유방암 순환종양세포의 EMT 특성과 전이 연관성
a. CTC 세포주와 Parental 그리고 전이 세포주에서 EMT 변화 조사
- CTC, 4T1-Parental, 4T1-Lung cell의 EMT 마커 조사
- CTC, 4T1-Parental, 4T1-Lung cell의 EMT 분자 조절 전사 인자 발현 변화 조사
b. CTC 세포주와 Parental 그리고 전이 세포주에서 전이 능력 조사
- CTC, 4T1-Parental, 4T1-Lung cell의 세포 이동 변화 조사
- CTC, 4T1-Parental, 4T1-Lung cell의 세포 침투변화 조사
- CTC, 4T1-Parental, 4T1-Lung cell의 3-D culture시에 침투 모양 조사
c. CTC clone에서 전이 조절 분자 변화 조사
- 각 clone의 EMT 정도 차이 탐색
- 각 clone의 EMT 조절인자 발현 차이
d. 탐색된 분자의 전이 기전 조사
- 각 clone중에서 가장 전이 특성이 높은 CTC와 그렇지 않은 CTC의 유전자 발현을 RNA micro array를 통해 탐색
- array를 통한 조절 유전자 후보 선별
- 각 후보 유전자 발현 조절에 따른 전이 특성 변화 조사.
(3) 3차년도(2019)
유방암 순환종양세포(CTC)의 전이원인 후보 유전자에 의한 전이 조절과 임상 연계
a. 탐색된 CTC의 전이 유전자의 전이 능력 변화 조사
- 후보 유전자 knock-down에 의한 전이 변화를 동물모델에서 조사
- Parental cell에 전이 유전자 과발현 후에 전이 변화를 동물모델에서 조사
b. 탐색된 분자억제에 의한 혈액속의 CTC 수의 변화 조사
- 후보 유전자 knock-down에 의한 혈액의 CTC 수의 변화를 전이동물모델에서 조사
- Parental cell에 전이 유전자 과발현 혈액의 CTC 수의 변화를 전이동물모델에서 조사
c. 사람 유방암에서 탐색된 분자의 발현 조사
- 타겟 후보의 임상 연계를 위해 사람의 유방암 샘플에서 발현 정도 조사
- 타겟 후보 유전자의 임상 자료 연계 (전이와 생존율등)
d. 탐색된 분자의 발현과 유방암예후 생존율 조사
- bioinformatics를 이용하여 타겟 분자와 유방암에서 생존율 관계를 조사
연구개발성과
•순환종양세포주 (CTC)의 분리, 배양, 세포주 확립 프로토콜 확립함
•순환종양세포주 (CTC)의 heterogeneous clone 분리 및 세포주 확립함
•CTC heterogeneity 특성 분석
-각 clone의 이질성을 cell growth로 조사하여 CTC의 세포 성장 속도는 다른 세포들에 비해 느림을 확인함
•유방암 순환종양세포의 EMT 특성과 전이 연관성
-CTC1은 parental과 CTC2에 비해 EMT가 일어난 모양을 보이며 epitheilal cell marker인 E-cadherin 발현이 감소되어있음 관찰함
-CTC1에서 ynk유전자의 발현이 증가되었음 확인
-특히 ynk유전자의 발현을 저하시키면 EMT의 현상이 줄어들어 E-cadherin 발현이 증가되고 epithelial cell morphology를 띄게됨
-ynk 유전자를 과발현하면 세포가 더욱 EMT가 일어나 E-cadherin 발현이 감소하고 fibronectin 발현 증가함을 확인 함
-FN, cell junction protein들도 suspended culture에서 발현이 증가하는 것으로 나타나며 FN 발현을 저해되었을 때 anoikis가 일어나며 cell junction protein들도 감소되는 것으로 나타남
•유방암 순환종양세포(CTC)의 전이원인 후보 유전자에 의한 전이 조절과 임상 연계
-유방암 환자의 stage가 높을수록 FN 발현이 증가되는 것으로 나타남
-Public data 분석을 통하여 유방암환자에서 Cell junction protein인 DSG, DSC와 PLKG의 발현이 높을수록 생존율이 감소되는 것으로 확인됨
연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
학문적 측면
- Circulating tumor cell의 특성을 생화학, 분자생물학적 방법으로 규명하고 이를 바탕으로 전이 억제제 개발 기초 자료 제공
- 새로운 CTC 표지 분자의 발굴은 새로운 전이 억제 타겟으로 사용 가능하며,이를 이용한 암전이 억제제 개발의 단서를 제공함.
산업적 및 경제적 측면
- 특히 암 전이는 암 관련 사망 원인의 90%이상을 차지하는데, 이 방법을 이용한 새로운 CTC regulators의 발굴이나 조절 기전을 규명하여 전이 억제 target을 발굴하여 이를 이용한 표적치료 신약이 개발된다면, 국가 경제에 지대한 공헌을 할것임.
임상적인 효과
- CTC에 대한 연구결과를 토대로 전이 예후 인자를 발굴할 수 있음
- CTC에 대한 연구결과를 토대로 혈액을 통한 암 진단 인자를 발굴할 수 있음
실용화 방안
- 전이된 세포와 parental 세포, 그리고 CTC의 표면 분자의 변화 비교로 CTC 마커를 발굴하여 circulating tumor cell을 감지 또는 분리하는 마커로 적용
- 마커를 타겟으로 암의 예후 예측 또는 진단의 마커로 사용 가능성 검증
(출처 : 요약문 14p)
Abstract
▼
Purpose&Contents
A. Fianl purpose:
Analyzing the heterogeneity and metastasis of CTCs provides the basis for developing therapeutics that inhibit cancer metastasis, liquid biopsy, drug response, and biomarker discovery.
B. Detailed target:
1. CTC isolation, culture, and cell line establi
Purpose&Contents
A. Fianl purpose:
Analyzing the heterogeneity and metastasis of CTCs provides the basis for developing therapeutics that inhibit cancer metastasis, liquid biopsy, drug response, and biomarker discovery.
B. Detailed target:
1. CTC isolation, culture, and cell line establishment protocol in breast cancer transgenic animals
2. Characterization of CTC heterogeneity
3. EMT and metastasis characterization of CTC
4. Exploring metastasis molecules and mechanisms of CTC
5. Investigating the presence of CTCs in animal models and exploring inhibitor of metastasis molecular
6. Analysis metastasis correlation with the discovered metastatic molecules in breast cancer
(1) First year (2017)
Isolation, culture and heterogeneity of circulating tumor cells using breast cancer metastasis model
a. CTC isolation and culture and cell line establishment protocol in breast
cancer metastasis animal model
-Establish metastasis model in syngeneic mouse using 4T1/luc cell
-Separation of CTC using ClearCell FX System
-Cultivate the separated CTCs
b. Isolation of heterogeneous clone and establishment of cell line of circulating tumor cell (CTC)
-Isolate each clone of isolated circulating tumor cell line
-Establish cell line by culturing each clone
-Investigate luciferase activity of each clone as a tumor origin
c. CTC heterogeneity characterization
-Investigate heterogeneity of each clone by cytomorphology
-Investigate heterogeneity of each clone by cell growth
-Heterogeneity of each clone was examined by expression of specific proteins in epidermal and mesenchymal cells
(2) Second year (2018)
Association of EMT characteristics and metastasis in breast cancer circulating tumor cells
a. Investigation of EMT changes in CTC and parental and metastatic cell lines
-EMT marker investigate of CTC, 4T1-Parental and 4T1-Lung cells
-Investigation of EMT molecular regulatory transcriptional expression in CTC, 4T1-Parental, and 4T1-Lung cells
b. Investigation of metastatic capacity in CTC, parental and metastatic cell line
-Investigation of cell migration of CTC, 4T1-Parental, and 4T1-Lung cells
-Investigation of cell invasion of CTC, 4T1-Parental and 4T1-Lung cells
-Investigation of cell invasion in 3-D culture of CTC, 4T1-Parental and 4T1-Lung cells
c. Investigating change of metastasis regulator in CTC Clone
-Search for differences in the degree of EMT of each clone
-Difference in expression of EMT regulators of each clone
d. Investigate the metastasis mechanism of discovered molecules
-Through the RNA microarray, the gene expression is detected of the most metastatic CTC and the other CTC among the clones
-Selection of regulatory gene candidates through array
-Investigate changes in metastasis characteristics by controlling the expression of each candidate gene
(3) Third year (2019)
Linkage of metastasis regulation and clinical trial by candidate genes that cause metastasis of breast cancer circulating tumor cells (CTC)
a. Investigate changes in the metastatic capacity of metastaisis genes of the discovered CTC
-Investigate metastatic changes caused by knockdown of candidate genes in animal model
-Investigate metastatic changes in animal models after overexpression of the metastasis genes in parental cells
b. Investigation of changes in the number of CTCs in the blood by the discovered molecular inhibition
-Investigation of changes in the number of CTCs in blood by knockdown of candidate gene in animal model
-Investigation of changes in CTC counts of blood after overexpression of metastasis genes in parental cells
c. Survey of molecular expression in human breast cancer
-Investigate the expression level in human breast cancer samples for clinical linkage of target candidates
-Linking clinical data of target candidate genes (metastasis and survival rate, etc.)
d. Explore the discovered molecular expression and survival of breast cancer prognosis
-Using bioinformatics to investigate survival relationship between target molecule and breast cancer
Results
•Establishment protocols for circulating tumor cell (CTC) Isolation, culture and cell line
•Establishment cell line and heterogeneous clone isolation of circulating tumor cell (CTC)
•CTC heterogeneity characterization
-Investigate heterogeneity of each clone by cell growth, confirming that CTC cell growth rate is slower than other cells
•Association of EMT characteristics and metastasis of breast cancer circulating tumor cells
-CTC1 showed more EMT than parental and CTC2, and the expression of E-cadherin, an epitheilal cell marker, was decreased
-Increased expression of ynk gene in CTC1
-In particular, downregulating the expression of the ynk gene reduces EMT, leading to increased E-cadherin expression and epithelial cell morphology
-Overexpression of the ynk gene resulted in more EMT cells, resulting in decreased E-cadherin expression and increased fibronectin expression
-FN and cell junction proteins also appear to increase expression in suspended cultures. When FN expression is inhibited, anoikis occur and cell junction proteins also decrease
•Linkage of metastasis regulation and clinical trial by candidate genes that cause metastasis of breast cancer circulating tumor cells (CTC)
-The higher the stage of breast cancer patients, the higher the expression of FN
-Public data analysis showed that the survival rate decreased as the expression of cell junction proteins, DSG, DSC and PLKG, increased in breast cancer patients
Expected Contribution
Academic aspect
-Characterize circulating tumor cells by biochemical and molecular biological methods and provide basic data for developing metastasis inhibitors
-The discovery of new CTC-labeled molecules could be used as a novel metastasis target, providing clues to the development of cancer metastasis inhibitors
Industrial and economic aspects
-In particular, cancer metastasis accounts for more than 90% of cancer-related deaths. The discovery of new CTC regulators or the mechanism of regulation using this method will lead to a significant contribution to the national economy if new target therapeutic drugs are developed by identifying metastasis suppression targets
Clinical effect
-Based on the research results of CTC, metastatic prognostic factors can be identified
-Based on the research results of CTC, blood can be used identify cancer diagnosis factor
Commercialization plan
-As a marker for detecting or isolating circulating tumor cells by discovering CTC markers by comparing changes of metastatic cells, parental cells, and surface molecules of CTC
-To verify targeted marker that its potential as a marker for predicting or diagnosing cancer
(source : SUMMARY 17p)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 보고서요약 ... 2
- 제출문 ... 12
- 보고서 요약서 ... 13
- 국문 요약문 ... 14
- SUMMARY ... 17
- 목차 ... 20
- 1. 연구개발과제의 개요 ... 22
- 1-1. 연구개발 목적 ... 22
- 1-2. 연구개발의 필요성 ... 22
- 1-3. 연구개발 범위 ... 23
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 24
- 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 25
- 4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 44
- 4-1. 목표달성도 ... 44
- 4-2. 관련분야 기여도 ... 46
- 5. 연구결과의 활용계획 ... 46
- 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 49
- 7. 연구개발성과의 보안등급 ... 49
- 8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 49
- 9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 50
- 10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 51
- 11. 기타사항 ... 52
- 12. 참고문헌 ... 53
- 끝페이지 ... 55
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