초록 ▼

연구의 목적 및 내용
○ 개발된 AAVmTORshRNA 안구내 주사용 AAV기반 황반변성 유전자치료제의 in vivo efficacy 검증 및 황반변성 치료기전 확립
- 유전자 치료제의 효과검증, 맥락막신생혈관 유도모델에서 AAV기반 치료제의 망막전달 연구, 맥락막신생혈관 발생과정에서 mTOR 경로의 역할 검증, 당뇨모델에서 치료제 특성에 최적화된 AAV 혈청형 결정 및 망막전달 특성 확인, 유리체 용적이 인간과 비슷한 토끼에서 주사법 개선
○ 가장 우수한 치료효능을 가진 rAAV 치료제 벡터의 비임상시험 및 GMP

연구의 목적 및 내용
○ 개발된 AAVmTORshRNA 안구내 주사용 AAV기반 황반변성 유전자치료제의 in vivo efficacy 검증 및 황반변성 치료기전 확립
- 유전자 치료제의 효과검증, 맥락막신생혈관 유도모델에서 AAV기반 치료제의 망막전달 연구, 맥락막신생혈관 발생과정에서 mTOR 경로의 역할 검증, 당뇨모델에서 치료제 특성에 최적화된 AAV 혈청형 결정 및 망막전달 특성 확인, 유리체 용적이 인간과 비슷한 토끼에서 주사법 개선
○ 가장 우수한 치료효능을 가진 rAAV 치료제 벡터의 비임상시험 및 GMP제조를 통한 IND신청 준비
- AAV 황반변성 치료제 GMP 생산 라인 구축, AAV-mTORshRNA 안전성 확보를 위해 개량된 stuffer DNA (SD) 포함 AAV-mTORshRNA-SD 효과 검증, 비임상 독성검사용 및 임상시험용 mTORshRNA-SD construct 제작 및 생산, 설치류를 이용한 전임상 독성시험 1 개 항목 이상 수행

연구개발성과
1. AAV-AntisenseVEGF-A 및 AAV-mTORshRNA 각각 안구내 주사후 맥락 막신생혈관 억제 확인
2. mTORshRNA의 경우 혈관신생억제 + 항염증작 용 + autophagy 활성화 효과 확인
3. 맥락막신생혈관 동물모델에서 염증관련 세포의 유입양상 및 치료에 의한 억제 효과 규명
4. AAV2, 5, 8의 안구내 주사 후 맥락막신생혈관 조직 전달능력의 비교 및 최적의 혈철형 확인 - AAV2 기반 mTOR 억제제 독성 시험 최종 결정
5. 3 종 건성황반변성 동물모델 구축; MNU, STZ의 케미컬 유도 및 SRT (국내 개발 신형 레이저)이용
a. 당뇨유발 망막증 모델에서 4 종의 혈청형의 rAAV 백터 전달능력 확인
b. MNU, SRT 및 레이저 의한 neuroinflammation 양상 확인
6. AAV2-mTORshRNA-SD 벡터 in vivo 효능분석 통해 기존rAAV2-mTORshRNA- GFP 벡터와 유사하거나 더 향상된 치료효능 검증(신생혈관크기비교)
7. rAAV2-shmTOR-SD의 경우 혈관신생억제 + 항염증작용 + autophagy 활성화 효과 확인
8. 맥락막신생혈관 (CNV) 유도후 신생혈관 활동성 차이의 시기별 차이 확립
a. mTORC1/C2 경로 관련성/활성화 경향을 시기별로 확인
b. CNV 구성 세포성분 중 염증세포는 mTORC1, 혈관관련 세포는 mTORC2 활성화 확인
9. STZ 유도 당뇨망막병증 모델에서 AAV2, 5, 8, 9 혈청형의 망막전달능력 차이 규명후 AAV2가 적합한 혈청형임을 확인하고, 병기의 진행에 따른 AAV 망막전달능 차이 확인 (AAV 수용체 발현의 시기별 차이가 원인임을 세계 최초 규명
10. 기존 유리체강내 주사법으로는 망막전달이 어려움 검증하고 새로운 안구내 주사법 개발 완료
11. GMP 생산된 AAV2-mTORshRNA-SD의 치료기전 확립 완료
12. 당뇨망막병증에서 AAV2-mTORshRNA-SD 치료효과 검증 완료
13. AAV2mTORshRNA(rAAV2-shmTOR-SD)를 이용한 비임상시험 독성시험 예비실험을 통한 조건 확립 및 단회투여 독성시험 완료
14. scAAV vectors 4종 생산 및 공급 : AAV-AShVEGF-A, AAV-mTOR shRNA, AAV-mTORshRNA- scrambled (대조군), scAAV2-eGFP
15. ssAAV vectors 4종 생산 및 공급 : ssAAV2-eGFP, ssAAV5-eGFP, ssAAV8-eGFP, ssAAV9-eGFP
16. AAV 포함 바이러스 기반 유전자치료제 GMP 제조소 구축 완료 AAV 벡터 GMP 생산 라인(장비 & 설비 등) 구축 완료
17. GMP AAV 치료제 품질 검증 방법 연구 : AAV 벡터 정량법 확립을 통해 생산한 AAV 벡터의 viral genomes titration 정보 제공
18. 기존 mTORshRNA 벡터가 포함하고 있는 리포터유전자, 즉 GFP 발현카세트를 삭제하고,대신 stuffer DNA를 삽입하여 바이러스 packaging이 이전 벡터와 동일하고 생산성 문제가 없음 확인
19. AAV 기반 치료제 벡터의 in vivo gene therapy 투여용 GMP 제조공정개발을 통해 harvest - lysis -benzonase 처리 - clarification after buffer dilution - CIEX 크로마토그래피 정제과정 -Concentration with formulation 공정 후 제균 및 여과 과정을 통해 회수율 23.41% 정도의 우수한 GMP 공정 확립 완료
20. GMP 제조용 세 종류 플라스미드, pRep/Cap, pHelper, pAAV-mTORshRNA-SD들은 안전성 확보를 위해 국내 식약처를 포함한 국제적인 규제기관에서 플라스미드가 함유한 ampicillin 저항성 유전자를 kanamycin 저항성 유전자로 대체할 것을 요구하므로 subcloning을 완료하고 염기서열분석을 통해 새로운 플라스미드 확보 검증함.
21. AAV2-mTORshRNA-SD GMP 제조를 위한 생산세포주로는 가장 생산효율성이 우수한 ATCC의 293T를 구매하여 MCB GMP 제조 준비를 완료함.
22. 전임상 독성시험 예비시험을 통해 조건을 수립하고 단회투여 13 주 독성시험 완료

연구개발성과의 활용계획 (기대효과)
1. IND fileing 준비라는 목표에 걸맞게 개발된 rAAV2-mTORshRNA-SD 유전자치료제의 치료효과 발현의 기전 확립하였고 이와 함께, 유전자치료제의 GMP 생산 준비를 완료하였으며, 본 연구과제에서 지원하는 범위의 전임상 독성시험 범위 이외에 설치류를 이용한 전체 전임상 독성시험 완료하였으며, 현재 별개의 투자를 통해 영장류 전임상 독성시험을 진행하고 있음. 그 결과를 통해 안전성 확보에 대한 추가 자료가 확보되면, 임상연구를 위한 IND를 신청할 계획임.
2. 결국 본 연구과제의 최종 목표는 IND filing의 준비를 하는 것이나, 결과에 따라 IND 신청을 하고 임상연구로 이행하는 것을 계획하고 있음. 실제 실제 개발에 활용할 계획임.

(출처 : 요약문 14p)

Abstract ▼

Purpose&Contents
○ Verification of in vivo efficacy of the developed rAAV2-mTORshRNA gene medicine product for wet AMD treatment with intraocular use and MOA establishment of the gene medicine product
- verification of therapeutic effect, evaluation of retinal transduction of AAV-mediated gene

Purpose&Contents
○ Verification of in vivo efficacy of the developed rAAV2-mTORshRNA gene medicine product for wet AMD treatment with intraocular use and MOA establishment of the gene medicine product
- verification of therapeutic effect, evaluation of retinal transduction of AAV-mediated gene medicine in the murine choroidal neovscularization (CNV) model
- evaluation of mTOR pathway during CNV development
- determination of the optimal rAAV serotype for diabetic retinopathy murine model
- improvement of intravitreal injection technique in rabbit eye
○ preclinical toxicology study with the best rAAV based gene medicine product for CNV and the data collection for the IND filing
- establishment of AAV based gene medicine product production line, evaluation of the efficacy with improved AAV2-mTORshRNA with sttufer DNA instead of GFP for the clinical safety
- GMP grade AAV2-mTORshRNA production for the preclinical toxicology study and clinical trial
- completion of 1 item of preclinical toxicology study with rodent

Results
1. evaluation of the therapeutic effect after intravitreal injection with AAV-AntisenseVEGF-A/AAV-mTORshRNA of each to CNV model
2. verification of AAV-mTORshRNA function with antiangiogenicity, antiinflammation and autophagy
3. evaluation of the inhibitory effects of AAV-mTORshRNA in the murine CNV model
4. comparison of the retinal transduction efficacy after intraocular injection with AAV2, 5, 8 serotype in CNV murine model and determination of the optimal serotype of rAAV vector – AAV2- mTORshRNA was determoned for the final candidate for the preclinical toxicology study
5. establishment of 3 different kinds of strophic retinal degeneration model with MNU, STZand SRT
a. confirmation of retinal transduction efficacy with 4 different serotypes of rAAV-GFP
b. evaluation of neuroinflammation pattern at the MNU. STZ, and laser-induced animal model
6. verufication of the therapeutic effect of AAV2-mTORshRNA-SD compared with rAAV2-mTORshRNA- GFP
7. verification of the anti-angiogenic and anti-inflammatory effects and autophagy pattern after intravitreal injection of rAAV2-shmTOR-SD to the murine CNV model
8. time dependent change of the neovasuclar activity after CNV induction
a. time dependent changes of the role of mTORC1/C2 pathway during CNV formation
b. confirmation of different role of mTORC1 to the inflammatory cell components and mTORC2 to the vascular cell components during the CNV formation
9. evaluation of retnal transduction of AAV2, 5, 8, 9 serotype in STZ-induced DM retinopathy model. - AAV2 and 9 was better for retinal transduction in DM condition
- this results were resulted from time-dependent expression change of receptor protein
10. verification of thel limitation of conventional intravitreal injection of AAV and development of novel and improved intravitreal injection technique
11. establishment of therpeutic function with GMP graded AAV2-mTORshRNA-SD in CNV murine model
12. establishmen of therpeutic function with GMP graded AAV2-mTORshRNA-SD in murine DM model
13. preliminary study establishment of murine preclinical toxicology study with rAAV2-shmTOR-SD and the completion of single dose injection toxicology study
14. production and supply of 4 different scAAV : AAV-AShVEGF-A, AAV-mTOR shRNA, AAV-mTORshRNAscrambled (control), scAAV2-eGFP
15. production and supply of 4 different ssAAV :ssAAV2-eGFP, ssAAV5-eGFP, ssAAV8-eGFP,ssAAV9-eGFP
16. establishment of mass production facility line for AAV based gene medicine products
17. establishment of QC method for GMP graded AAV based gene medicine products
18. improvement of AAV2-mTORshRNA-GFP with AAV2-mTORshRNA-SD
19. development of GMP facility for in vivo gene therapy based on AAV
20. etablishment of kanamycin resistant pRep/Cap, pHelper, pAAV-mTORshRNA-SDGMP for GMP production
21. completion of MCB GMP production for AAV2-mTORshRNA-SD
22. Completion of single dose injection toxicology at 13 week time points

Expected Contribution
1. As with the final gol of this project, therapeutic mechanism of developed gene medicine product,rAAV2-mTORshRNA-SD was established and GMP facility and production protocol was also prepared. and preclinical study with rodent was also finished with the budget supported by this project funding and the bigger portion supported by private investment. and now preclinical toxicity study with the nonhuman primate is also being performed. if the result of the preclinical toxicology study were accptible, IND filing for clinical trial would be submitted.
2. The goal of this project was the preparation and data building. So with the results of the preclinical toxicology study, if the resuls were acceptible, the final product, rAAV2-mTORshRNA-SD will be moved to the clinical trial.

(source : SUMMARY 15p)