[보고서]바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 P 단백질 변이가 VHSV RNA 합성 및 IFN system에 미치는 영향 분석

박정우

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 P 단백질 변이가 VHSV RNA 합성 및 IFN system에 미치는 영향 분석
The effects of variation in phosphoprotein of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) on viral RNA synthesis and IFN system 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	울산대학교 University of Ulsan
연구책임자	박정우
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2022-03
과제시작연도	2021
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202200014747
과제고유번호	1711132850
사업명	개인기초연구(과기정통부)(R&D)
DB 구축일자	2022-11-09
키워드	P 단백질.변이.인터페론.병원성.VHSV.P protein.variation.interferon.virulence.

초록 ▼

□ 연구개요
연구목표:
VHSV P 단백질 변이가 P 단백질의 인산화에 영향 주어 VHSV RNA 합성 및 숙주 세포의 IFN system 조절을 통하여 VHSV 성장 및 병원성을 조절하는 지를 확인
연구내용:
- VHSV P 단백질 변이가 P의 인산화에 미치는 영향 분석
- VHSV P 단백질 변이가 VHSV RNA 합성에 미치는 영향 분석
- VHSV P 단백질 변이가 숙주세포의 IFN system에 미치는 영향 분석

□ 연구 목표대비 연구결과
○ VHSV P 단백질 변이가 P의 인산화에 미치는 영향 분석
- VHSV P 단백질의 55번 아미노산 변이된 것 [VHSV-P(P55), VHSV-P(P55L)]을 pcDNA vector에 클로닝 후 HINAE 세포에서 발현 확인
- VHSV-P(P55)와 VHSV-P(P55L) clone을 transfection 한 HINAE 세포에 Poly I:C, 혹은 10 MOI의 VHSV를 처리 후 VHSV-P의 인산화 정도를 확인함.

○ VHSV P 단백질 변이가 VHSV RNA 합성에 미치는 영향 분석
- Recombinant VHSV를 사용하여 VHSV P(P55L) 변이가 세포주에서 VHSV 성장을 증가시킴을 확인, 또한 넙치에 감염시 병원성이 증가함을 확인
- Recombinant VHSV를 사용하여 VHSV P(P55L) 변이가 VHSV P 변이가 세포주에서 VHSV (+) strand 및 (-) strand RNA 합성을 증가시킴을 확인
- VHSV P(P55L)을 지니는 plasmid를 넙치 세포에 과발현시킨 후 VHSV를 감염시켰을 때 VHSV (+) strand 및 (-) strand RNA 합성을 증가시킴을 확인

○ VHSV P 단백질 변이가 숙주세포의 IFN system에 미치는 영향 분석
- VHSV P(P55L)을 지니는 recombinant VHSV를 감염시킨 세포의 transcriptome 분석을 통하여 VHSV P 변이가 숙주세포 IFN system을 억제함을 확인
- VHSV P(P55L)을 지니는 recombinant VHSV를 감염시킨 넙치의 transcriptome 분석을 통하여 VHSV P 변이가 넙치의 IFN system을 억제함을 확인

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
○ 바이러스 증식 및 병원성 조절에 대한 정확한 이해는 바이러스의 감염 pattern 예측 및 바이러스에 대한 치료제 개발에 중요한 정보를 제공하여 줌.
○ 본 연구는, VHSV의 P 단백질 변이에 의하여 VHSV 성장 및 병원성이 증가할 수 있다는 예비 결과를 바탕으로 계획하였음.
○ 지금까지 전 세계적으로 VHSV의 병원성을 결정하는 인자/유전자 변이를 규명하고자 많은 노력이 있었지만 아직까지 확인되고 있지 않음. 따라서 본 연구에서 수행할, VHSV P 단백질 변이에 의한 VHS 성장 및 병원성 조절 기작은 세계 최초로 밝히는 새로운 기작임.
○ 본 연구 결과는 어류 rhabdovirus 병원성의 새로운 조절 기작을 세계 최초로 밝히는 것으로써, VHSV 이외에 IHNV 등의 다른 어류 rhabdovirus 병원성 조절 기작 규명 연구에도 적용 가능함.
○ 또한 고병원성 VHSV P 단백질의 인산화를 억제하는 물질을 대상으로, VHSV의 치료제 개발에 필요한 정보를 제공하여 줄 수 있음.
○ 이와 같이 본 연구는 어류 rhabdovirus 증식 및 병원성의 조절 기작을 세계 최초로 규명하는 것으로 우수성 및 독창성이 매우 뛰어나다고 판단됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
1) 연구의 목표 및 내용 ... 4
2) 연구의 필요성 ... 5
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 9
가. 연구 방법: 1차년도(VHSV P 단백질 변이가 P의 인산화에 미치는 영향 분석) ... 9
나. 연구 방법: 2차년도(VHSV P 단백질 변이가 VHSV RNA 합성에 미치는 영향 분석) ... 10
다. 연구 방법: 3차년도(VHSV P 단백질 변이가 숙주세포의 IFN system에 미치는 영향 분석) ... 10
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 11
1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 11
2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 15
3) 목표 달성 수준 ... 16
4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 16
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 17
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 17
6. 참고문헌 ... 18
붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 20
붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 21
끝페이지 ... 27

표/그림 (20)

표 Rhabdovirus structure and life cycle
표 Rhabdovirus genome structure. VHSV belongs to Genus Novirhabdovirus containing NV gene in its genome stricture (ICTV 9th Report 2011)
표 Distribution of VHSV
표 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of VHSV G
표 RNA polymerase complexes of rhabdovirus to carry out transcription and replication of viral genomic RNA
표 Mechanisms of immune evasion of rhabdovirus
표 Mortality of 20 VHSV strains isolated from cultured flounder in Korea. (A) Representative cumulative mortility of flounder. (B) Average cumulative mortality of 20 VHSV strains (three independent experiments)
표 Phylogenetic trees based on amino acid sequences of N, M, G, NV, L, and P of 20 VHSV strains
표 Alignment of amino acid sequences of P, G, and L protein of 20 VHSV strains
표 (A) Generation of recombinant VHSVs. (B) Growth of rVHSVs in flounder HINAE cells
표 Prediction of phosphorylation sites within P proteins of low pathogenic VHSV-5 and high pathogenic VHSV-19 strains using NetPhos 3.1 server
표 Hypothetical model to explain how VHSV P protein variation affects P protein phosphorylation, viral RNA synthesis, and host IFN system
표 Cloning of VHSV P(P55) and VHSV P(P55L) into pcDNA6 plasmid vector and confirmation of their expression in cells by western blot
표 Comparison of phosphorylation of VHSV-P(P55) and VHSV-P(P55L) in HINAE cells after stimulation with Poly I:C or VHSV infection. HINAE cells were transfected with plasmid containing VHSV-P(P55) or VHSV-P(P55L). Cells were treated with Poly I:C(50ug/ml) for 6h or 10 MOI VHSV for 1 h and harvested. Western blot was conducted by using anti-V5, anti-phospho-serine, anti-phospho-threonine antibodies
표 Effect of the PP55L amino acid substitution on VHSV virulence in flounder. Graphs represent cumulative mortality of olive flounder infected with rVHSV-wild and rVHSV-P. Olive flounder (43.9 ± 7.43g) were intraperitoneally injected with (A) 2.3 × 104 PFU/fish or (B) 2.3 × 105 PFU/fish of rVHSV-wild or rVHSV-P at 13˚C. Fish injected with phosphate-buffered saline were used as the mock control. Fish mortality was monitored daily (n = 20 per group)
표 Effect of the PP55L amino acid substitution on viral RNA synthesis in HINAE cells. HINAE cells were infected with (A and B) low-virulence ADC-VHS2015-5, high-virulence ADC-VHS2012-6, (C and D) rVHSV-wild, or rVHSV-P at a multiplicity of infection of 1 PFU per cell, and cells were collected at the indicated time points. The accumulation of (B and D) VHSV genome copies (negative sense) and (A and C) G gene messenger RNA copies and anti-genomes (positive-sense) in the VHSV-infected cells was determined by strand-specific real-time PCR. The expression levels obtained from mock-infected cells were set to 1. The results are presented as the mean ± SD of three independent experiments. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ns, not significant
표 Effects of ectopic expression of VHSV P(P55) or VHSV P(P55L) on the viral RNA synthesis. HINAE cells were transfected with pcDNA6-P-wild or pcDNA6-P(P55L). (A) Western blot analysis for the expression of VHSV P in plasmid-transfected HINAE cells using anti-V5 antibody. (B and C) Plasmid-transfected HINAE cells were infected with ADC-VHS-2015-5 or ADC-VHS-2012-9 at 1 MOI. At 24 h post-infection, cells were collected and accumulation of (B) G gene messenger RNA copies and anti-genomes (positive-sense) and (C) VHSV genome copies (negative sense) in VHSV-infected cells was determined by strand-specific real-time PCR
표 KEGG pathway analysis of flounder 168 genes up-regulated in high virulent rVHSV-P infected cells compared to rVHSV-infected cells
표 KEGG pathway analysis of flounder 209 genes down-regulated in high virulent rVHSV-P infected cells compared to rVHSV-infected cells
표 Effects of one amino acid substitution PP55L on the IFN response in HINAE cells and flounder. (A-C) HINAE cells were infected with rVHSV-wild, or rVHSV-P at 1 MOI and cells were collected at the indicated time points. The expression levels of (A) IFN1, (B) ISG15, and (C) Mx in VHSV-infected HINAE cells were determined by real-time PCR. The results are presented as the mean ± SD of three independent experiments. **, p<0.01; ***, p<0.001. (D and E) Olive flounder (43.9 ± 7.43g) were intraperitoneally (i.p.) injected with 2.3 x 105PFU/fishofrVHSV-wildandrVHSV-Pat13 °C. At the indicated time points, kidney, spleen, liver tissues were collected from anesthetized fish and the expression levels of (D) ISG15 and (E) Mx in the tissues were determined by real-time PCR. The results are presented as the mean ± SD of three independent experiments. **, p<0.01. (F and G) HINAE cells were transfected with pcDNA6-P-wild or pcDNA6-P(P55L). pcDNA6 empty vector was used as a control. Cells were treated with 5 μg/ml blasticidin for 2 weeks to enrich plasmid-bearing cells. HINAE cells transfected with pcDNA6-P-wild, pcDNA6-P(P55L), or empty vector pcDNA6 as in Fig. 5 were infected with ADC-VHS-1015-5 at 1 MOI. At 6 h post-infection, cells were collected and the expression levels of (F) IFN1 and (G) Mx in VHSV-infected HINAE cells were determined by real-time PCR. The results are presented as the mean ± SD of three independent experiments. **, p<0.01; ***, p<0.001

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