[보고서]뱀장어 번식시스템의 염분 민감 전사체 동정 및 기능 연구

권준영

뱀장어 번식시스템의 염분 민감 전사체 동정 및 기능 연구
Identification & functional study of salinity-sensitive transcripts in the reproductive system of eels 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	선문대학교 SunMoon University
연구책임자	권준영
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2023-03
과제시작연도	2022
주관부처	과학기술정보통신부 Ministry of Science and ICT
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO202300009495
과제고유번호	1711161294
사업명	개인기초연구(과기정통부)
DB 구축일자	2023-10-11
키워드	뱀장어.염분.전사체.번식시스템.성숙.Eel.Salinity.Transcriptome.reproductive system.maturation.

초록 ▼

□ 연구개요
뱀장어 인공 종자 생산 기술의 한계 극복을 위한 단서를 얻기 위하여 여러 가지 조건 하(담수, 해수, 해수+SPE)에서 성 성숙 유도 후 뇌(brain), 뇌하수체(pituitary) 및 생식소(gonad)의 전사체를 비교 분석하였음.

□ 연구 목표대비 연구결과
1차년도에는 인공해수와 SPE를 이용하여 뱀장어 성 성숙 유도에 성공하였으며(자연산란 개체까지 출현) 전사체 분석을 위한 조직별 표본을 확보하였음.
2차년도에는 뇌, 뇌하수체 및 생식소의 전사체를 비교 분석하여 성숙 유도 조건에 따라 유전자 발현 경향이 다름을 확인하였으며, 생식소 발달단계가 유사한 뱀장어일수록 HPG축 transcriptome의 상호 유사성이 높은 것을 알아내었음. 또한 DEG 분석을 통해 성공적으로 성 성숙이 유도된 개체에서 30배 이상 차별적으로 발현하는 유전자들을 선별하여 뱀장어 성 성숙 유도과정에서 중요한 역할을 할 후보 유전자로 분류하였고, 1000개 이상의 염분민감전사체(SST)를 확인하였음.
3차년도에는 전사체 분석을 통해 선별한 염분민감전사체 및 SPE민감전사체의 기능을 확인하기 위해 뇌하수체 세포를 이용한 in vitro 실험을 실시하였음. 뇌하수체 세포는 SPE에 반응하여 생식소자극호르몬의 하나인 LHβ 유전자 발현 증가를, NaCl에 반응하여 prolactin 유전자 발현 감소를 보였음. 뇌하수체 세포는 또한 P4에 의해 생식소자극호르몬 유전자 발현 증가를 보였으며, 멜라토닌 및 세로토닌에 반응하여 주요 호르몬 유전자 발현에 변화를 나타내었음.
이상의 연구 결과는 SPE에 의존하고 있는 현재의 뱀장어 인공 성 성숙 유도 기술에 변화가 필요함을 시사함. 연어와 뱀장어는 서로 반대의 번식 회유 방향을 가지고 있어서 SPE가 함유하고 있는 일부 호르몬 특히 염분이나 삼투압조절 관련 요소들은 뱀장어의 정상적 난 발달에 부정적 영향을 미칠 수도 있음.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
활용계획
- 연구를 통해 획득한 뱀장어 transcriptome data의 지속적으로 분석하여 유익한 학술 논문을 생산함.
- 염분민감전사체들의 기능에 대한 추가 연구를 추진할 계획임.
- 본 연구의 결과는 성공적 뱀장어 성 성숙 유도를 위해 prolactin, P4, melatonin 및 serotonin과 같은 요소를 보정한 새로운 성숙 유도 호르몬 칵테일의 개발을 제안함.

기대효과
- 뱀장어 주요 조직(뇌, 뇌하수체, 생식소)의 mRNA profile 파악
- Silvering (실버링, 은화) 및 성 성숙 관련 핵심 유전자군 파악
- 뱀장어 성 성숙과정에서 염분의 역할 이해 향상
- 뱀장어 성숙유도 기술 개선을 위한 정보 제공
- 부화 자어의 초기 생존율 개선 기대

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

표지 ... 1
연구결과 요약문 ... 2
목차 ... 3
1. 연구개발과제의 개요 ... 4
2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
가. 뱀장어 성 성숙 유도(1차 년도) ... 5
1) 성 성숙 유도 조건별 사육 ... 5
2) 호르몬 처리 및 표본채취 ... 5
3) 생식소 발달단계 조사 ... 7
4) 호르몬 분석 및 GTH 유전자 발현 조사 ... 7
나. Transcriptome (전사체) 비교 분석(2차 년도) ... 8
1) Transcriptome 분석을 위한 RNA 추출 ... 8
2) cDNA library 제작 및 RNA sequencing ... 9
3) 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEGs) 분석 ... 9
4) qRT-PCR을 통한 RNA-sequencing 검증 ... 12
다. 염분민감유전자와 성성숙 연관성 조사(3차 년도) ... 13
1) 뇌하수체에서 번식 관련 유전자 선별 ... 13
2) 뇌하수체 in vitro 실험 ... 13
3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 17
4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 18
가. 학문적 측면에서의 기대 효과 ... 18
나. 기술적 및 산업적 측면에서의 기대 효과 ... 18
5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 18
6. 자체점검표 ... 19
7. 참고문헌 ... 19
[붙임1] 세부 정량적 연구개발성과 ... 21
[붙임2] 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 22
끝페이지 ... 24

표/그림 (37)

표 연구 추진 내용 및 연차별 진행도.
표 A photograph (A) and schematic diagram (B) of recirculation system used for the induction of sexual maturation of eels.
표 Measurement of body length and height (A), body weight (B), body circumference (C) during the induction of sexual maturation of eels. SPE injection (D).
표 Changes in appearance of eels by the repeat of SPE injection every week. FW+SPE: freshwater with weekly SPE injection, SW+SPE: seawater with weekly SPE injection.
표 Morphometric and physiological indices of the reared at four eels different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation induction
표 GSI (A) and HSI (B) of the eels reared at four different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation. GSI and HSI results are expressed as means±S.E.M. (n=6). Different letters above the bars represent significant differences.
표 Photographs of gonads from the eels reared at four different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation.
표 Histological status for the gonads obtained from the eels reared at four different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation. (A) FW. (B) SW. (C) FW+SPE. (D) SW+SPE. Scaled bar=50 ㎛. N: nucleus, Od: oil droplet.
표 Level of E2 in the plasma obtained from the eels reared at four different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation. E2 results are expressed as means±S.E.M. (n=6).
표 Expression levels of LHβ (A) and FSHβ (B) in the pituitaries obtained from the eels reared at four different conditions for 8 weeks (FW, SW, FW+SPE and SW+SPE) to induce sexual maturation. Relative abundance of the mRNA was measured by the comparative threshold cycle method using qRT-PCR and normalized th the amount of β-actin mRNA. Results are expressed as means ±S.E.M. (n=6). Different letters above the bars represent significant differences (p<0.05).
표 Workflow of transcriptome analysis.
표 RNA-sequencing statistics for the pituitaries, brains and gonads of eels obtained from different conditions of sexual maturation induction
표 Distribution of transcripts with various number of zero counts for the pituitaries, brains and gonads of eels obtained from different conditions of sexual maturation induction.
표 Correlation between transcriptomes of eel pituitary (A) brain (B) gonad (C) from different conditions of sexual maturation induction.
표 Hierarchical clustering heatmap of the top 3000 genes expressed in the pituitary (A) brain (B) and Gonad (C) obtained from different conditions of sexual maturation induction.
표 Number of DEGs for 15 analysis combinations in the pituitary (A), brain (B) and gonad (C) obtained from conditions of sexual maturation induction.
표 Potential key genes selected based on high FC values in the pituitary obtained from different conditions of sexual maturation induction
표 Potential key genes selected based on high FC values in the brain obtained from different conditions of sexual maturation induction
표 Potential key genes selected based on high FC values in the gonad obtained from different conditions of sexual maturation induction
표 KEGG classification of DEGs for SW vs FW, FW+SPE vs FW, SW+SPE vs SW and SW+SPE vs FW. The X axis shows the numbers of DEGs. The Y axis shows KEGG pathway.
표 Validation of the expression of 8 genes in transcriptome data by RT-qPCR. β-Actin was used as a reference gene.
표 Venn diagram showing number of DEGs between 3 group pairings obtained from different conditions of sexual maturation induction.
표 Potential key genes selected from genes related to reproduction pathway among the 75 salinity and/or SPE sensitive transcripts
표 Morphometric and physiological indices of experimental eels
표 Photographs of eel brain and pituitary. (A) Location of eel brain (arrow). (B) Location and isolation of eel pituitary (arrow).
표 Photographs of microscopic observation of eel pituitary cell culture. The pituitary of eel was cultured for 24 (A), 48 (B) and 96 (C) hours and then photographed by a camera. Scaled bar = 100 ㎛.
표 Photographs of microscopic observation of eel pituitary cell culture. The pituitary of eel was treated with control (A), NaCl (B) SPE (C) and NaCl+SPE (D) and cultured for 6 hours, and then photographed by a camera. Scaled bar = 100 ㎛.
표 Primers used for quantitative real-time PCR (qRT-PCR) of eel pituitary cell culture in control, NaCl, SPE and NaCl+SPE groups
표 Expression levels of LHβ (A), FSHβ (B) and PRL (C) in control, NaCl, SPE and NaCl+SPE groups eel pituitary cell culture. Relative abundance of the mRNA was measured by the comparative threshold cycle method using qRT-PCR and normalized th the amount of β-actin mRNA. Results are expressed as means±S.E.M. (n=3-4). Different letters above the bars represent significant differences (p<0.05).
표 Expression levels of drd4 (A), NPBWR2 (B), rxfp3-2b (C) and pgrl (D) in control, NaCl, SPE and NaCl+SPE groups eel pituitary cell culture. Relative abundance of the mRNA was measured by the comparative threshold cycle method using qRT-PCR and normalized th the amount of β-actin mRNA. Results are expressed as means±S.E.M. (n=3-4). Different letters above the bars represent significant differences (p<0.05).
표 Potential key genes selected based on high FC values in the pituitary obtained from different steps of sexual maturation induction
표 Morphometric and physiological indices of experimental eels
표 Experimental groups and treatment concentrations
표 Primers used for quantitative real-time PCR (qRT-PCR) of eel pituitary cell culture in Experiment.1, 2
표 Expression of FSHβ, LHβ, GH, and SL genes after treatment of progsterone and estrogen for each group (Control, P4, E2 and E2+P4).
표 Expression of FSHβ, LHβ, GH, and SL genes after treatment of melatonin for each group (Control, Melatonin 고농도, Melatonin 저농도).
표 Expression of FSHβ, LHβ, GH, and SL genes after treatment of Serotonin for each group (Control, 5HT 고농도, 5HT 저농도).

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
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