초록 ▼

본 연구는 결핵균 즉 Mycobacterium tuberculosis가 야기 시키는 질병인 결핵에대한 항결핵 후보물질을 생체내에서 유효성을 평가하기 위한 연구이다. 이를 위하여 본 연구진은 결핵균과 진화 계통적으로 유사한 Mycobacterium marinum을 제브라피쉬의 배아와 성체에 각각 감염시켜 약물을 처리한 후 생체내 생균수, 사멸곡선 그리고 생체내 치료를 통하여 결핵균을 사멸 시킬 수 있는 약물을 생체내에서 평가 할 수 있는 유효성 모델을 발전시켰다.

이를 위하여 본 연구진은 우선적으로 제브라피쉬를 사육하고

본 연구는 결핵균 즉 Mycobacterium tuberculosis가 야기 시키는 질병인 결핵에대한 항결핵 후보물질을 생체내에서 유효성을 평가하기 위한 연구이다. 이를 위하여 본 연구진은 결핵균과 진화 계통적으로 유사한 Mycobacterium marinum을 제브라피쉬의 배아와 성체에 각각 감염시켜 약물을 처리한 후 생체내 생균수, 사멸곡선 그리고 생체내 치료를 통하여 결핵균을 사멸 시킬 수 있는 약물을 생체내에서 평가 할 수 있는 유효성 모델을 발전시켰다.

이를 위하여 본 연구진은 우선적으로 제브라피쉬를 사육하고 교배하여 알을 획득한 후 배아를 생성시키는 기술을 정립하여 프로토콜화 하였다. 제브라피쉬 감염은 크게 배아 감염과 성체 감염으로 나뉘며, 성체 감염은 다시 복강 감염과 근육 감염으로 나뉘어 진행되었다. 이를 위하여 우선 본 연구진은 발달된 제브라피쉬 배아에 M. marinum을 감염시키는 방법을 정립하였으며 또한 제브라피쉬 성체를 사용한 M. marinum 감염을 각각 복강 그리고 근육 감염으로 확립하여 시간에 따른 감염 균주의 생체내 전파 및 결핵의 전형적인 특징인 육아종 형성 및 발달을 확인하였다. 또한, 감염된 제브라피쉬 배와와 성체의 정확한 정량을 위하여 복합항생제의 M. marinum에 대한 영향을 평가하였으며, 감염에 따른 제브라피쉬 성체의 무게 감소도 측정하여 결핵의 전형적인 특징인 의도치 않은 체중 감소 역시 M. marinum에 감염된 제브라피쉬 성체에서도 일어남을 확인할 수 있었다.

또한, 이 연구의 최종 목표인 감염된 제브라피쉬 배아와 성체에서 생체내 유효성을 확인하기 위하여 기존 항결핵제와 신약 파이프라인에 있는 Q203등의 신약을 사용하여, 이러한 약물들이 M.marinum에 감염된 제브라피쉬를 치료할 수 있음을 실험적으로 증명하였다. 마지막으로, 제브라피쉬 배아와 형광 M. marinum의 감염을 통하여 96 well plate 포맷에서 본 연구진이 확립한 감염-약물치료 시스템이 스크린 모델로 사용될 수 있음을 Z’값 계산을 통하여 증명하였다.

종합적으로, 감염 제브라피쉬 감염 모델은 배아와 성체에서 항결핵제의 약효를 빠른시간안에 측정할 수 있으며, 약물 라이브러리를 사용해서 후보물질을 도출할 수 있는 스크린에도 사용될수 있음을 본 과제를 통하여 실험적 증명하였다. 앞으로 본 모델을 사용하여 결핵에 유효한 물질 평가와 새로운 신약 개발이 생체내에서 신속히 이루어지길 기대해본다.

(출처 : 요약문 4p)

Abstract ▼

In this study, we have focused to evaluate the effectiveness of anti-tuberculosis (TB) agents for tuberculosis that is caused by Mycobacterium tuberculosis, in vivo. To this end, we developed an in vivo efficacy model through infection of Mycobacterium marinum, which is systematically similar to M.

In this study, we have focused to evaluate the effectiveness of anti-tuberculosis (TB) agents for tuberculosis that is caused by Mycobacterium tuberculosis, in vivo. To this end, we developed an in vivo efficacy model through infection of Mycobacterium marinum, which is systematically similar to M. tuberculosis into embryos and adults of zebrafish (ZF). Through this infection, we could observe disease progress using fluorescent M. marinum, CFU titration, granuloma formation that have been seen in TB animal model.

For this, foremost, we developed protocol about methods of ZF maintanence, breeding, and embryo development. Zebrafish infection was largely divided into embryonic infection and adult infection. For this, we first established a method of infecting M. marinum into ZF embryos and then we also settle down the protocol for adult ZF infection. This adult ZF infection was again divided into intraperitoneal and intramuscular infection. Over these infections, we confirmed the formation and development of in vivo disease progress, granulomas formation and in vivo efficacy as well. In adult ZF model of infection, we could also observe weight loss of infected ZF as those was seen in TB patient and animal model such as mouse model of infection.

In addition, we also evaluated drug in vivo effcacy in ZF larvae model using existing anti-TB drugs and new drug candidate such as Q203 which is in the in the new anti-TB drug pipeline. This in vivo efficacy also carried out in adult ZF model in acute and chronic model of infection-treatment. Finally, through the Z' value calculation, we confirm that this in vivo efficacy system in ZF larvae model that established by our team can be applicable for novel drug screen in 96-well plate format in combination with fluorescent M.marinum.

Overall, here, we developed M. marinum-ZF infection model experimentally. This model provide the simple and accurate tool to evaluate in vivo efficacy of anti-TB drugs in embryos and adults. Furthermore, this model can be used to screens that can derive novel anti-TB candidate using drug libraries. In the future, we hope that this model will be used to evaluate drug effectiveness for tuberculosis in many laboratories and develop new drugs quickly in vivo.

(source : Summary 5p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 학술연구개발용역과제 연구결과 ... 6
• 제1장 최종 목표 ... 6
• 제2장 국내외 기술 현황 ... 19
• 제3장 최종 연구 내용 및 방법 ... 25
• 제4장 최종 연구 결과 ... 41
• 제5장 연구결과 고찰 및 결론 ... 108
• 제6장 연구성과 및 활용계획 ... 110
• 제7장 연구용역과제 진행과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 113
• 제8장 기타 중요변경사항 ... 113
• 제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 ... 114
• 제10장 참고문헌 ... 116
• 제11장 첨부서류 ... 118
• 끝페이지 ... 282