초록 ▼

□ 연구개발 목표 및 내용
◼ 최종 목표
후성유전적 변이에 의한 3차원 크로마틴 구조변형 기전 규명을 통한 난소암 항암제 내성 치료타겟 유전자 발굴
1. 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이에 의한 크로마틴 3차원 구조의 변형 분석
2. 크로마틴 3차원 구조 변형에 의한 유전자 발현조절 기전 규명
3. 항암제 내성환자의 종양조직에서 크로마틴 3차원 구조 변형 검증
4. 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이 교정을 통한 항암제 내성 치료효과 검증
5. 임상에 적용

□ 연구개발 목표 및 내용
◼ 최종 목표
후성유전적 변이에 의한 3차원 크로마틴 구조변형 기전 규명을 통한 난소암 항암제 내성 치료타겟 유전자 발굴
1. 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이에 의한 크로마틴 3차원 구조의 변형 분석
2. 크로마틴 3차원 구조 변형에 의한 유전자 발현조절 기전 규명
3. 항암제 내성환자의 종양조직에서 크로마틴 3차원 구조 변형 검증
4. 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이 교정을 통한 항암제 내성 치료효과 검증
5. 임상에 적용 가능한 항암제 내성 억제를 위한 치료 타겟 유전자 발굴

◼ 전체 내용
< 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이에 의한 크로마틴 3차원 구조의 변형 분석 >
1. 뉴클레오솜 위치 변형 지도 작성
- 시스플라틴 감성 난소암 세포주 A2780 과 내성 세포주 A2780cis DNA에서 unmodified histone H3 antibody를 이용한 Chip-seq analysis를 시행하여 뉴클레오솜 위치 지도를 작성함.
- 항암제 내성 특이적 뉴클레오솜 위치 변형과 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이 profile을 통합 분석하여 DNA methylation에 의한 뉴클레오솜 위치 변형을 선별함.
2. 항암제 내성 특이적 크로마틴 3차원 구조 지도 작성
- A2780과 A2780cis DNA에서 Hi-C analysis를 수행하여 long-range chromatin interaction을 검출함.
- UCSC Genome DB를 이용하여 CTCF/cohesin을 비롯한 long-range chromatin interaction의 mediator들의 putative binding site를 검색함.
- putative binding site와 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이 profile을 통합 분석하여 DNA methylation 변이에 의해 interction mediator들의 결합력에 영향을 미칠 수 있는 유전자 locus를 선별함.

< 크로마틴 3차원 구조 변형에 의한 유전자 발현조절 기전 규명 >
1. 뉴클레오솜 위치 변형에 의한 유전자 발현변화 확인
- A2780과 A2780cis DNA에서 H3K4me3, H3K9me3, RNA pol II antibody를 이용하여 ChIP assay를 시행하여 항암제 내성 특이적 뉴클레오솜의 위치 변형 지역의 chromatin 상태를 확인하고 관련 유전자의 발현과 DNA methylation 상태와의 연관성을 분석함.
- Demethylating agent 처리 후 ChIP assay를 시행하여 chromatin 상태 변화에 따른 관련 유전자의 발현 변화를 분석하고 DNA methylation에 의한 뉴클레오솜 위치 변형이 유전자 발현에 미치는영향을 조사함.
2. long-range chromatin interaction 변형에 의한 유전자 발현변화 확인
- A2780과 A2780cis DNA에서 mediator antibody를 이용한 ChIP assay를 시행하여 항암제 내성 특이적 CpG site에서 mediator들의 결합력 차이를 비교 분석함. ChIP assay를 통해 long-range chromatin interaction에 관여하는 mediator를 선별하고 mediator의 결합력과 관련 유전자의 발현 사이의 연관성을 분석함.
- Demethylating agent 처리 후 항암제 내성 특이적 CpG site에서 mediator들의 결합력과 유전자 발현 변화를 분석하여 DNA methylation 변이에 의한 mediator 결합력 변화를 확인함.
- 선별된 mediator들의 발현을 siRNA를 이용하여 knockdown 시킨 후 해당 유전자의 발현 변화와 long-range chromatin interaction 증감 여부를 조사함.

< 항암제 내성환자의 종양조직에서 크로마틴 3차원 구조 변형 검증 >
- 기 확보한 113명의 난소암 환자의 종양조직에서 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이를 pyrosequencing을 이용하여 검출하여 확인함.
- ChIP assay를 이용하여 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이에 따른 뉴클레오솜 위치 변형, long-range chromatin interaction에 관여하는 mediator의 결합력 변화 등을 확인함.
- 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이에 의해 크로마틴 3차원 구조가 변형된 유전자의 발현변화를 확인함.

< 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이 교정을 통한 항암제 내성 치료효과 검증 >
- A2780cis 세포주에서 크로마틴 3차원 구조 변형에 관여하는 항암제 내성 특이적 DNA methylation 변이를 dCas9-effector fusion system을 이용하여 site-specific하게 DNA methylation 변이 교정을 시행한 후 항암제 반응성 변화 여부를 cisplatin cytotoxicity assay로 분석함.

□ 연구개발성과
Deep-learning 기법을 이용하여 cisplatin 저항성을 90% 정확도로 예측할 수 있는 모델 개발 4건의 국제학술대회 논문발표

□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
1. 기존 연구에서 DNA methylation에 의한 유전자 발현조절 메카니즘을 주로 promoter에 한정하여 인접한 지역의 전사인자들과의 결합 여부 등으로 제한적으로 해석한 것을 탈피하여 DNA methylation에 의해 조절되는 크로마틴 3차원 구조의 신규 조절 메카니즘을 제시함. DNA methylation 변이와 크로마틴 3차원 구조 사이의 관계 규명을 통해 DNA methylation 변이에 따른 유전자 발현 조절기전을 이해하기 위한 근본적인 이론을 정립하는데 기여할 수 있음.
2. 또한, 항암제 내성을 획득하게 되는 원인과 과정을 크로마틴 3차원 구조 관점에서 새롭게 규명할 수 있는 신규 패러다임 제시가 가능함.
3. 본 연구결과로 발굴된 항암제 내성 극복을 위한 치료타겟 유전자는 향후 효과적인 항암치료제 개발에 핵심적인 단초를 제공할 수 있음.
4. 크로마틴 3차원 구조로 인해 가능한 원거리 조절인자와 프로모터간의 상호작용 규명으로 인해 유전자 발현 조절 네트워크에 대한 정확한 이해가 가능하며 기존에 해석이 어려웠던 비전사지역에 존재하는 유전적 변이의 기능을 규명 하는데 핵심적인 역할을 수행할 수 있음; GWAS data의 새로운 분석 및 해석 가능
5. 지금까지 축적해 온 많은 유전체와 후성유전체 데이터를 통합적으로 해석할 수 있는 새로운 패러다임의 분자 기전을 제공할 수 있음.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 4
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 5
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 5
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 6
• 1) 연구수행 결과 ... 6
• 2) 목표 달성 수준 ... 10
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 11
• 5. 연구개발성과 및 활용 계획 ... 11
• 1) 연구성과 ... 11
• 2) 연구성과 활용계획 ... 12
• 6. 참고문헌 ... 12
• 끝페이지 ... 12