초록 ▼

□ 연구개발 목표 및 내용
■ 최종 목표
● 해면동물은 생물학적, 화학적 다양성을 토대로 가치 있는 연구대상으로서 많은 연구가 이루어져 왔다. 대부분의 해면동물은 많은 양의 해수를 필터하는(filter-feeding) 방식으로 영양분을 섭취하는 것으로 알려져 있고, 이 과정에서 다양한 해양미생물이 해면체 내에 걸러지고 공생 하게 되면서 체내에 많은 수의 공생미생물 군집을 포함하여 생물학적 다양성을 나타낸다. 또한 해면동물은 다양한 구조와 생리활성을 가지는 대표적인 해양천연물의 보고이다.
● 해양천연물 중 그 비율이

□ 연구개발 목표 및 내용
■ 최종 목표
● 해면동물은 생물학적, 화학적 다양성을 토대로 가치 있는 연구대상으로서 많은 연구가 이루어져 왔다. 대부분의 해면동물은 많은 양의 해수를 필터하는(filter-feeding) 방식으로 영양분을 섭취하는 것으로 알려져 있고, 이 과정에서 다양한 해양미생물이 해면체 내에 걸러지고 공생 하게 되면서 체내에 많은 수의 공생미생물 군집을 포함하여 생물학적 다양성을 나타낸다. 또한 해면동물은 다양한 구조와 생리활성을 가지는 대표적인 해양천연물의 보고이다.
● 해양천연물 중 그 비율이 가장 높은 해면동물의 이차대사산물은 최근 해면동물-공생미생물 메타지놈 분석을 통하여 그 주요생산자가 공생미생물이라는 다수의 연구가 보고되었다. 대부분의 공생미생물이 실험실 환경에서 배양되기 어려워 연구가 미진했음에도 불구하고 메타지놈(metagenome) 분석결과에서 공생미생물의 뛰어난 이차대사산물 생합성 잠재력이 확인되었다. 하지만 아직까지 해면동물-공생미생물의 이차대사산물의 연관성에 관한 연구와 공생미생물을 포함하는 마이크로바이옴 및 유전자 수준에서의 생합성 잠재력을 탐색한 연구는 미진한 실정이다.
● 본 연구에서는 한국에서 자생하는 해면동물의 마이크로바이옴 메타지놈 라이브러리를 구축하고, 메타지놈 마이닝을 통하여 신규 이차대사산물 생합성에 관여하는 유전자를 분석하고자 한다. 또한 신규 이차대사산물 잠재 유전자 클러스터를 발굴 해내어 이를 벡터에 클로닝하고 이종발현 하고자 한다. 이를 통해 신규 이차대사산물을 실험적으로 분리하고 지속적인 생산이 가능하게 하여 신약개발에 활용 할 수 있도록 해면동물 마이크로바이옴 유래 해양천연물을 탐색하고자 한다.
■ 전체 내용
1) 1단계: 한국 자생 해면유래 마이크로바이옴의 메타지놈 라이브러리 구축
● 한국 자생 해면동물을 채집 한 후 해면동물세포와 미생물세포를 분리하여 마이크로바이옴의 유전체군집을 추출하여 메타지놈 라이브러리를 만든다. 메타지놈 라이브러리는 다양한 공생미생물들의 유전체 조각들로 이루어지며, 타겟으로 하는 생합성 유전자클러스터 스크리닝 및 메타지놈 시퀀싱을 하기 위한 실험적 포맷이라고 할 수 있다.
2) 2단계: 해면동물 마이크로바이옴의 메타지놈 시퀀싱 및 분석
● 1단계에서 얻어진 공생미생물의 유전체군집 전체 염기서열을 얻기 위하여 NGS (next generation sequencing) 기술을 이용하여 메타지놈의 whole genome sequencing을 수행한다. 얻어진 메타지놈 염기서열은 일차적으로 16S rRNA를 표적으로 한 염기서열 분석을 통해 미생물총의 계통수를 파악하고 해면동물의 종에 따라 공생 하고 있는 미생물군집간 계통수를 비교 분석 하여 기본적인 해면동물-공생미생물간 생태학적인 분석을 수행한다.
● 미생물의 이차대사산물은 상당히 다양한 구조를 가지지만 그들의 생합성 기구들은 유전적으로 놀랍도록 보존적으로 진화해 왔다. 이는 곧 이차대사산물 생합성 효소들의 핵심 아미노산 염기서열들이 높은 상동성을 가지는 것을 뜻한다. 이러한 생합성 기구의 보존적인 염기서열 특징을 이용하여 다양한 이차대사 산물 생합성 유전자를 탐색 할 수 있다. 본 연구에서는 대부분의 생리활성 이차대사산물의 구조적인 특징을 나타내는 polyketide 및 none-ribosomal peptide의 생합성 기구(PKS(polyketide synthase)와 NRPS(none-ribosomal peptide synthetase)를 생물정보학(bioinformatics) 기반의 툴을 사용하여 잠재적인 신규 이차대사산물 클러스터를 탐색하는데 중점을 둘 계획이다.
3) 3단계: 메타지놈 이차대사산물 생합성 유전자 스크리닝 및 발현
● 2단계의 메타지놈 분석을 통하여 클로닝 하고자 하는 특정 생합성 유전자클러스터를 타겟으로 하는 프라이머를 제작하여 원하는 유전자클러스터를 스크리닝하고, 이를 벡터에서 assembly하여 클로닝 한다.
● 클로닝한 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해 호스트 균주로서 방선균을 이용하여 호스트내 발현조절 시스템을 이용하여 신규이차대사산물 유전자 클러스터의 발현이 가능하도록 이종발현을 수행한다.
● 만일 클로닝된 유전자가 이종발현시에 발현되지 않으면 프로모터 엔지니어링, 발현조절 유전자 등을 탐색(BGC regulator mining) 등을 시도한다.
4) 4단계: 이차대사산물 분리/구조분석 및 생리활성 탐색
● 3단계 이종발현으로부터 성공적으로 이차대사산물이 생산되면 순수하게 각 물질을 분리하여 화학적인 구조를 결정한다. 최근 천연물 화학구조는 상대구조(평면구조)뿐만 아니라 절대구조까지 밝히는 것에 큰 의미를 두는 방향으로 연구되어 왔다. 다양한 크로마토그래피법 및 분광분석방법을 통해 상대구조를 결정하고, 절대구조를 위해 화학반응 및 단결정 X-선 회절 분광법을 이용하여 화학구조분석을 수행한다.
● 앞선 단계에서 수행한 유전자클러스터의 분석을 통해 알 수 있는 분자의 부분적인 화학구조(아미노산의 D/L 형태, stereo center의 S/R, 할로겐 원자의 추가 등)의 구조적인 정보를 종합적으로 분석할 수 있으므로 더욱 정확한 구조분석이 가능하리라 생각된다.
● 분리된 천연물은 다양한 생리활성평가를 통하여 신약개발의 가능성을 평가할 수 있다. 유전자 클러스터 및 화학구조분석을 통해 예측할 수 있는 생리활성을 우선적으로 평가하여 효율적으로 접근 할 계획이다.

□ 연구개발성과
해면동물의 타겟으로하는 이차대사산물(할리실린드라마이드)의 실제 생산자가 미생물임을 생합성유전자 분석을 통하여 발견하였고, 할리실린드라마이드의 생합성 유전자 전체를 최초로 규명하였다. (논문 준비중)

□ 연구개발성과 활용계획 및 기대 효과
● 연구가 미진했던 한국 자생 해면동물 공생미생물의 계통구성 및 이차대사산물 생합성 유전자클러스터를 메타지놈 마이닝을 이용하여 생태학적 특성과 생리활성을 가지는 신규 이차대사산물 생산 가능성을 탐색한다. 많은 해양천연물의 본래 생산자라고 알려진 공생미생물의 높은 천연물생산 가능성을 확인하고, 그 생합성 유전자의 이종발현을 통해 신규한 해양천연물을 지속적인 공급이 가능하게 할 수 있도록 하는 본 연구는 신약개발에 있어 활용도가 무척 높다.
실험실 환경에서 배양 및 발현되지 않았던 공생미생물의 신규이차대사산물 유전자 클러스터를 밝히고 그의 발현을 통해 신규 해양천연물을 연구하는 점은 국내 천연물 연구에 있어서 신규성이 높은 연구법이라 생각된다. 또한 모든 연구단계에 걸쳐 다양한 학문(해양생물학, 미생물학, 유전학, 생태학, 생물정보학, 유기화학, 천연물학)을 적용하여 새로운 천연물 연구방법을 제시하여 천연물과학의 연구 분야를 확대 한다. 본 연구를 기반으로 하여 산업계에서의 메타지놈 활용기술 개발을 촉진시키는 수단을 제공하고 유래 천연물 신약 개발 면에서 동기 부여, 기술 제공 및 실용화에 활용될 수 있다.
● 신약개발이 성공하면 경제적인 파급효과가 엄청나지만 그만큼 개발과정에는 긴 시간과 노력, 경제성이 투입되어야 한다. 본 연구는 신약개발의 discovery 전 주기에 걸쳐 새롭고 효율적인 연구방법을 제시하고, 발굴된 신규 천연물들은 신약개발 과정에서 경제적, 산업적 측면의 고부가가치 창출을 기대할 수 있다.

(출처 : 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 요약문 ... 2
• 목차 ... 5
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 5
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 6
• 1) 1단계: 한국 자생 해면유래 마이크로바이옴의 메타지놈 라이브러리 구축 ... 6
• 2) 2단계: 해면동물 마이크로바이옴의 메타지놈 시퀀싱 및 분석 ... 6
• 3) 3단계: 메타지놈 이차대사산물 생합성 유전자 스크리닝 및 발현 ... 6
• 4) 4단계: 이차대사산물 분리/구조분석 및 생리활성 탐색 ... 6
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 정도 ... 7
• 1) 연구수행 결과 ... 7
• 2) 목표 달성 수준 ... 12
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도 ... 12
• 5. 연구개발성과 및 활용 계획 ... 13
• 1) 연구성과 ... 13
• 2) 연구성과 활용계획 ... 13
• 6. 참고문헌 ... 14
• 끝페이지 ... 14