초록 ▼

□ 연구개요
본 연구의 최종목표는 정상적인 RhD 및 RhCE 표현형 및 한국인에서 가장 흔한 D 음성 표현형의 원인이 되는 DEL형을 대상으로 long-read NGS를 활용하여 염기서열 유사도가 높은 RHD와 RHCE를 구분하여 유전자형 분석할 수 있는 검사 방법을 확립하고 한국인에서의 유전자형 빈도에 따른 RHD/RHCE 일배체형 레퍼런스 DB를 구축하는 것임.

□ 연구 목표대비 연구결과
1. RHD 및 RHCE 유전자형 분석을 위한 target enrichment method 개발
- 해당 유전자

□ 연구개요
본 연구의 최종목표는 정상적인 RhD 및 RhCE 표현형 및 한국인에서 가장 흔한 D 음성 표현형의 원인이 되는 DEL형을 대상으로 long-read NGS를 활용하여 염기서열 유사도가 높은 RHD와 RHCE를 구분하여 유전자형 분석할 수 있는 검사 방법을 확립하고 한국인에서의 유전자형 빈도에 따른 RHD/RHCE 일배체형 레퍼런스 DB를 구축하는 것임.

□ 연구 목표대비 연구결과
1. RHD 및 RHCE 유전자형 분석을 위한 target enrichment method 개발
- 해당 유전자 영역 전반을 포함하는 영역의 Long range PCR을 통한 target enrichment를 위하여 primer 제작 및 실험 조건을 확립하였음. 특히 RHD와 RHCE의 경우 두 유전자 사이의 서열 유사도가 93.8% 이상으로 매우 높아, 유전자 전 영역에 걸쳐 유전자 특이적 증폭에 의해 target enrichment 시행이 필요하여, RHD~RHCE에 이르는 ch1.의 전체 영역을 서로 overlap되는 36개의 영역으로 나눈 뒤, ARMS (amplification refractory mutation system)을 활용하여 모든 대상 영역에서 성공적으로 유전자 특이적 증폭 할 수 있는 실험 조건 확립하였음.
2. RHD 및 RHCE 유전자형 염기서열분석 수행
- Long read sequencing법으로 염기서열분석을 진행하기 위하여, PacBio SMRT-seq의 CCS(circular consensus sequencing) 시스템으로 RHD, RHCE 유전형에 최적화된 library 제작하는데 성공하였음. Enrichment 된 target 부위들에 대하여 성공적으로 sequencing 진행하였음.
3. RHD 및 RHCE 일배체별 유전자형 분석 알고리즘 개발
- PacBio사에서 제공하는 분석 파이프라인인 SMRT Link 및 자체적으로 개발한 분석 파이프라인에 의해 기존 RHD 및 RHCE 유전자형 참조 유전체 서열과 대비한 한국인의 유전자형 빈도를 분석하였음.
4. 임상검체를 이용한 RHD 및 RHCE 일배체별 유전자형 분석법 평가
- 수혈용 혈액제제의 출고 후 폐기되기 직전의 잔여 분절을 활용하여, 개발된 실험법 및 분석법의 평가작업을 진행하였음 (정상 RhD 및 RhCE 형, DEL 형 등 총 3 샘플). 또한, 면역학적 표현형 결과에 의해 결정된 유전자형과 비교분석을 수행하였음.

□ 연구개발성과의 활용 계획 및 기대효과(연구개발결과의 중요성)
1. LR-PCR 및 long-read sequencing을 이용한 유전형 분석
- 현재까지 HLA 등 면역원성과 연관된 인간의 주요한 유전자에 유전형 검사는 차세대 염기서열분석법(NGS)을 이용한 고해상도 검사법이 상용화의 수준까지 발전되어 있으나, 이들 검사법은 short read sequencing 기반으로 이루어져 NGS의 약점인 phasing ambiguity를 해결할 수 없었고, 유전형 분석은 대립유전자 빈도 등에 기초하여 추정하여야만 하였음. 본 연구에서 사용된 long read sequencing은 리드간의 phasing을 가능케 하여, 대립유전자 수준의 유전형을 정확히 알 수 있게 하는 기술임.
2. RHD 및 RHCE 유전자형 분석의 의의
- RhD 및 RhCE 항원은 적혈구 표면에 존재하는, ABO 항원 다음으로 강한 면역원성과 임상적 의의를 가진 주요 항원임. 하지만, 분자유전학적 분석 난이도의 측면에서 가장 높은 난이도를 가진 유전자인 RHD/RHCE에 의해 코딩되는 항원이기도 한데, 이는 RHD와 RHCE가 진화적 단계의 어떤 시점에서 서로 갈라진 것으로 추정되는 paralogous gene으로, 서열 유사도가 매우 높고 길이도 길기 때문임. 따라서 본 연구에서는 long-read sequencing을 이용하여 RHD와 RHCE의 유전자형 데이터베이스를 확립할 수 있는 실험 및 분석방법을 수립하였으며, 이는 추후 임상검사에 적용할 수 있는 발판이 될 것으로 생각됨.

(출처 : 연구결과 요약문 2p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 연구결과 요약문 ... 2
• 목차 ... 3
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 4
• 2. 연구개발과제의 수행 과정 및 수행 내용 ... 4
• 1) RHD 및 RHCE 유전자형 분석을 위한 Target enrichment method 개발 ... 4
• 2) RHD 및 RHCE 유전자형 염기서열분석법 선정 ... 7
• 3) RHD 및 RHCE 유전자형 분석 알고리즘 개발 ... 8
• 4) 헌혈 혈액 폐기용 분절 샘플을 이용하여 파이프라인 검증 및 실험 결과 확인 ... 8
• 3. 연구개발과제의 수행 결과 및 목표 달성 수준 ... 11
• 1) 정성적 연구개발성과(연구개발결과) ... 11
• 2) 세부 정량적 연구개발성과 ... 12
• 3) 목표 달성 수준 ... 12
• 4) 목표 미달 시 원인 분석 ... 12
• 4. 연구개발성과의 관련 분야에 대한 기여 정도(연구개발결과의 중요성) ... 12
• 5. 연구개발성과의 관리 및 활용 계획 ... 13
• 6. 자체점검표 ... 14
• 7. 참고문헌 ... 14
• 붙임1. 세부 정량적 연구개발성과 ... 15
• 붙임2. 연구책임자 대표적 연구실적 및 증빙(요약문 및 사본) ... 16
• 끝페이지 ... 16