[보고서]공포 발현의 신경회로적 분석을 통한 스트레스장애 치료전략 개발

김정훈

보고서 정보

주관연구기관

포항공과대학교
Pohang University of Science and Technology

연구책임자

김정훈

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2022-12

과제시작연도

2022

주관부처

과학기술정보통신부
Ministry of Science and ICT

등록번호

TRKO202300011996

과제고유번호

1711157415

사업명

뇌과학원천기술개발

DB 구축일자

2023-10-25

키워드

인지 장애.외상 후 스트레스 장애.외상 후 스트레스 장애 동물 모델.시냅스 가소성.편도체 내부 신경회로.분자네트워크.신경망 영상화.단일세포 전사체.Cognitive disorder.Post-traumatic stress disorder.PTSD animal model.Synaptic plasticity.Amygdala microcircuit.Molecular network.Molecular network.Single cell transcriptome.

표 Corticosterone을 복강 주사한 마우스는 공포조건화 후 대조군과 비교하여 Context (왼쪽)와 CS (-) (오른쪽)에 공포반응이 증가하는 공포일반화 증상을 보임.
표 Physical stress의 유무에 따른 공포조건화
표 Physical restraint와 tail shock을 가한 생쥐에서 24시간 후 나타나는 공포일반 화 반응.
표 PTSD 생쥐모델에서 공포기억 소멸 학습과 공포기억 소환 반응.
표 ErbB4 KO 동물의 자극 분 별도(discrimination). ErbB4 KO 마우스가 감소된 discriminative index를 보임. Discriminative index는(CS- - CS+)/(CS- + CS+)의 수식으로 계산되며 낮을수 록 증가된 공포일반화를 의미함.
표 공포조건화 실험에서 ErbB4 KO 생쥐 모델이 대조군보다 적은 수준의 freezing을 보였으 나 24시간 후에 novel cue에서 반응하여 공포반응을 보이는 공포 일반화 현상이 대조군보다 더 많이 나타남.
표 공포소멸 학습 실험조건하에서 ErbB4 KO 생쥐모델과 대조군의 비교.
표 Coricosterone 복강주사로 발생하 는 공포 일반화 현상은 도파민 수용체4 (Drd4) 길항제 (agonist)를 편도체 측핵에 투여하는 것으로 rescue하기에 충분함.
표 편도체 측핵에 추체신경세포 (Pyramidal neuron)에서 ITCd와 CEl로의 흥분성 신호세기가 도파민 수용체4 길 항제 (D4 agonist)에 의해 감소현상이 CORT 복강주사군에서 특이적으로 발견됨
표 편도체 측핵의 추체신경세포 (Pyramidal neuron) 편도체 측핵 내 SOM (+) 개재신경세포로의 흥 분성 신호세기는 도파민 수용체4 길항제 (D4 agonist)에 의해 CORT 복강주사군에서 변화하지 않음.
표 c-fos tTA 유전자 변형 마우스와 Tet-Off 시스템을 함께 사용하여 편도체의 측핵에서 공포조건화 학습에 의해 활성화 된 세포를 표지함.
표 세포 종류 제한적 신경활성 의존적 표지 및 유전자 발현 시스템. c-fos tTA x Vgat-Cre 이중 유전자 변형 마우스와 Cre-lox 시스템을 함께 사용하여 편도체 측핵에서 공포조건화 학습에 의해 활성화 된 흥분성 신경세포만 특이적으로 표지하고 채널로돕신-EYFP를 발현시킴.
표 Stress-induced PTSD 마우 스모델에서의 활성 신경세포 표지. (A) 트라우마 스트레스를 통한 PTSD 마우스모델 실험방법 요약. (B) 편도체 측핵에서의 활성세포 표지. (C) 편도체 중심핵에서의 활 성세포 표지. 초록, 공포조건화 학 습으로 인해 활성화 된 신경세포; 빨강, 트라우마 스트레스로 인해 활성화된 신경세포.
표 형광타이머를 이용한 활성화 시점이 다른 신경세포군의 동시 표지
표 CORT-induced PTSD 마우스모델에서의 활성 신경세포 표지. (A) CORT 복강주사로 유도한 PTSD 동물모델을 이용한 실험방법 요약. (B) CORT를 복강주사한 마우스의 편도체와 편도체 기저 핵에서의 c-fos 발현 (좌, 중), Saline을 복강주사한 대조군 마우스의 편도체 기저핵에서의 c-fos 발현. (C) 편도체 측핵, 중심핵, 전전두엽에서의 c-fos 발현 비교. (D) 편도체 기저핵에서의 c-fos 발현 비교.
표 Stress-induced 마우스 모델을 이용한 스트레스에 취약한 마우스 그룹과 스트레스에 저항성이 있는 마우스 그룹 간의 c-fos mRNA 발현정도 비교.
표 neural cell 모델 구축 및 SLAM-seq 기법 적용
표 SLAM-seq condition 및 data QC
표 신경세포타입 특이적 형광표지세포 유세포 분리
표 SST-Cre와 tdTomato line을 활용한 신경세포 분리
표 프로토콜 최적화에 따른 유세포분석 수득률 개선
표 공포기억발현 편도체 신경세포 유전자 발현분석
표 배아신경발생 모델에서 선택적 신경회로 표지기법 도입
표 CORT-induced PTSD 동물 모델과 대조군 사이의 편도체 내 시냅스 가소성 비교. CORT-induced PTSD 모델에서만 편도체 측핵 추체신경세포의 시냅 스 내 신경전달물질 분비 비율이 높은 것으로 나타남.
표 CORT-induced PTSD 동물모 델에서의 DRD4의 역할. DRD4 길항제 처리 후 CORT 복강주사군의 흥분성 신호세기가 약화되었으며, 신경전달물 질 분비 비율이 대조군과 유사하게 됨 을 관찰함.
표 ErbB4 KO PTSD 동물모델 의 편도체 중심핵 내 억제성 뉴런 의 mIPSC 비교. ErbB4 KO 마우 스의 경우 시냅스 내 소낭 속 신경 전달물질의 양이 적고, 분비 빈도 가 적은 것을 확인함.
표 면역 염색과 FACS를 통한 단일 세포군 분리. A) 뇌부위에 존재하는 세 포를 단세포로로 분리하고, B) FITC signal이 높게 검출되는 세포를 분리한 뒤, C) ChAT과 Pdyn, Penk의 mRNA 양을 조사함. ChAT과 ChAT’는 서열 이 서로 다른 primer를 이용하여 ChAT의 존재를 거듭 검증한 것임. Pdyn; prodynorphin, Penk; proenkephalin.
표 채널로돕신을 이용한 활성표지된 세포의 시냅스 가소성 조절. A) 실험에 사용한 형질전환 마우스와 바이러스.(좌) 실험 타임라인.(우) B) 채널로돕신을 이용한 iLTD 유발과 patch clamp recording을 통한 iLTD 검증의 모식도. C) 채널로돕신을 발현한 PV 신경세포를 470nm 빛을 이용해 반복적으로 활성화함으로써 활성표지된 세포가 PV 신경세 포로부터 받는 억제성 시냅스의 iLTD를 성공적으로 유발하였다. D) 시 냅스 장기약화 실험 전후 실행된 patch clamp recording의 모식도. 시 냅스 장기약화 전후로 thalamic 혹은 cortical pathway를 자극하여 시 냅스 신호를 편도체 측핵의 활성표지된 세포에서 측정했다. E) iLTD를 유도한 전후 EPSC의 amplitude F) iLTD를 유도한 전후 IPSC의 amplitude G) iLTD를 유도한 전후 IPSC와 EPSC의 amplitude ratio(I/E ratio)
표 채널로돕신을 이용한 활성표지된 세포의 시냅스 가소성 조절과 이를 통한 공포 일반화행동 제 어. A) 실험에 사용한 형질전환 마우스와 바이러스.(좌) 실험의 타임라인.(우) B) 바이러스에 의해 채 널로돕신이 발현된 편도체 측핵과 광학적 자극에 이용된 광섬유의 위치. C) 채널로돕신을 이용해 iLTD 유발한 실험군의 마우스의 공포반응 변화. D) 형광단백질 EYFP만 발현시킨뒤 iLTD를 유도한 대조군의 공포반응 변화. E) iLTD 전후 실험군과 대조군의 변별도 지수의 변화.
표 Corticosterone을 이용한 공포 일반화 증가와 Drd4 agonist를 이용한 공포 일 반화 행동 제어. (A) 실험의 타임라인 (B) 공포학습 직후 corticosterone을 복강에 주 사한 뒤 증가한 공포 일반화 현상과 Drd4 작용제를 편도체 측핵에 주사함에 따라 줄 어든 공포 일반화 현상.
표 Zfp536 생쥐의 발달분석. A. perinatal lethality와 B, C. 대뇌피질 두께 증가가 확인됨.
표 hZNF536-GFP 세포주 동정. IMR32 세포에 hZNF536-GFP를 lentiviral transduction으로 도입하 고, 단백질(A) mRNA (B) 수준에서 hZNF536-GFP의 안정적 발현을 확인함.
표 hZNF536의 신경발달 기능. ZNF536발현 세포주로부터 형성된 neurosphere를 배양하여 dendrite 유사구조의 형성(A)과 세포 이동(B, C)을 확인함.
표 발달과정 중 ZNF536의 단일 세포 발현패턴 분석. A. GAD1 발 현 interneuron과 비교한 ZNF536 발현 세포군. B. 신경세포 마커발현 패턴과 ZNF536의 발현 의 비교.
표 hZNF536-GFP 세포주 전사체 분석. 차별발현유전자의 A. volcano plot. B. gene ontology 분석 및 C. interneuron 마커발현 변화.
표 ChIPseq 분석. A. 전사체 결과와 ChIPseq 복합 분석. B. Promoter proximity volcano plot. C. GO analysis, D. DNA binding consensus sequences
표 PV 세포와 공포기억세포 시냅스 후 GABA A 수용체 alpha 1 구성물질 발현. 면역 전자현미경 법을 이용하여 EYFP, mCherry, GABA alpha 1 세 가지 항체를 사용하여 PV 신경 말단과 공포 기 억세포체 사이의 GABA A 수용체 alpha 1의 시냅스 후 발현을 비교함. A) 공포기억세포와 비 공포기 억세포체의 PV 시냅스 (초록색) 후 부위에서 GABA 수용체 alpha 1 구성물의 발현이 있는 면역 전자 현미경 대표 사진. B) PV 시냅스 부위는 공포기억세포와 비(非) 공포기억세포에서 차이는 없었느나, 시냅스 후 GABA alpha 1 면역 particle의 밀집도는 공포기억세포에서 유의적으로 높았음.
표 공포 기억흔적 세포체에서의 GABA 수용체 alpha1 발현 양상. A) 피라미드 공포 기억흔적 세포체 (초록색) 신호와 겹치는 alpha1 구성요소 (빨간색)의 발현 양상을 보여주는 대표적인 이미지. B) 공포 discriminator와 generalizer에서의 공포 기억흔적 세포의 alpha1 발현 밀도 및 크기 비교. generalizer 에 비해 discriminator에서 세포체에서의 alpha1 발현 밀도 및 평균 크기가 유의적으로 증가됨. C) 기억흔 적세포체의 alpha1 크기 및 밀도를 이용한 support vector machine의 discriminator와 generalizer의 분류 성능을 수신자 조작 특성 곡선을 통해 보여줌. 곡선 아래 면적이 0.7로 측정됨.
표 전체 뇌의 Sst+ 뉴런에서 Erbb4를 cKO한 마우스에서 PTSD-like behavior 확인. A) 청각적 공포 조건화 실 험에서 학습에는 두 그룹간 차이가 없음. B) 공포일반화 실험에서 cKO 마우스가 novel cue에 대한 freezing이 유 의미하게 높음. C) 공포 소거 학습에서 cKO 그룹이 유의미하게 freezing을 높게 보임. D) 공포 소거 기억이 cKO 그룹에서 정상적으로 형성되지 않음.
표 편도체 중심핵(Central amygdala; CeA)의 Sst+ 뉴런에서 Erbb4를 cKO한 마우스에서 PTSD-like behavior 확인. A) 청각적 공포 조건화 실험에서 학습에는 두 그룹간 차이가 없음. B) 공포일반화 실험에서 cKO 마우스가 novel cue에 대한 freezing이 유의미하게 높음. C) 공포 소거 학습에서는 두 그룹간 차이가 없음. D) 공포 소거 기 억이 cKO 그룹에서 정상적으로 형성되지 않는 경향을 보임.
표 Corticosterone injection 이후 DRD4 발현의 감소. A) 청각적 공포 조건화 학습 이후 편도체 조직을 채취해 qPCR을 통해 Drd4 mRNA의 양을 측정함, B) Fluorescence in situ hybridization (FISH)를 이용하여 편도체 내 세부 핵 중 mRNA 발현량을 측정함. C) Immunohistochemistry (IHC)를 이용하여 DRD4 단백질의 양을 측정함.
표 Corticosterone injection 이후 Npas4의 발현 감소. A) 청각적 공포 조건화 학습 이후 편 도체 조직을 채취하여 Npas4 mRNA의 변화량을 측정함. B) qPCR (Quantitative PCR)을 통해 3가지 초기반응유전자 (Immediate early gene, Npas4, c-Fos, Arc) 중 Npas4만이 Cort 주사 이후 mRNA 수준이 감소함을 보임. C) Immunohistochemistry (IHC)를 통해 편도체 내에서 Cort 주사에 의해 Npas4 단백질의 양이 감소함을 보임.
표 Cut & Tag을 이용해 Npas4에 의한 DRD4 발현 조절 기작을 발견. A) Cut & Tag 의 모사도. Npas4와 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 Npas4가 결합한 유전자 서열 을 채취한 뒤 시퀀싱을 통해 해당 유전자 서열을 확인함. B) Npas4가 DRD4의 promoter 영역에 결합할 수 있음을 보임. (C) Luciferase assay를 통해 Npas4가 DRD4 promoter 이하의 유전자 발현을 조절할 수 있음을 보임.

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